0   引言

在过去20年里, 局部肿瘤的冻融治疗已经有了长足的发展, 主要集中在肝癌^[1]、转移性癌^[2]、肾癌^[3]、前列腺癌^[4]等实体瘤治疗中。同时, 越来越多的报道表明, 冻融治疗可以破坏肿瘤, 增强或诱导细胞免疫或抗肿瘤免疫应答^[5-7]。此外, 肿瘤细胞的破坏和溶解可能成为炎性反应的重要介质^[8]。

库普弗细胞(Kupffer cells, KCs)是数量最大的免疫细胞, 占肝脏巨噬细胞的80%~90%, 也是单核吞噬细胞系统的重要组成部分, 在肝脏巨噬细胞的发生发展中起着重要的作用^[9]。KCs的激活与多种细胞因子的分泌密切相关, 这些细胞因子参与免疫和促炎或抗炎反应^[10]。KCs自身还具有分泌炎性因子的功能, 参与肝脏中各种重要的生理和病理过程, 如炎性反应、脂质代谢、移植免疫等^[11]。

因此, 有必要研究冻融后KCs分泌功能的特征, 帮助我们治疗肝癌, 促进患者的早期康复, 为肝癌冻融治疗能提高自身免疫功能的学说提供理论依据。为此, 本研究通过体外细胞实验, 从兔肝中提取KCs并进行了体外培养, 应用NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)阻断NF-κB信号通路后, 观察KCs的分泌功能变化, 探索冻融治疗引起KCs功能变化的机制。

1   材料与方法

1.1   材料

NF-κB抑制剂PDTC购自美国BioVision公司; 胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司; 低糖DMEM完全培养基购自美国ATCC公司; 0.4%锥虫蓝溶液购自美国Sigma公司; GAPDH购自英国Abcam公司; 蛋白Marker(10~170 kDa)购自立陶宛Fermentas公司; 0.45 μm PVDF膜购自美国Millipore公司; SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、蛋白抽提试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、ECL化学发光试剂盒、PMSF(100 mmol/L)、磷酸化蛋白酶抑制剂、5×蛋白上样缓冲液、10×丽春红染液和抗体洗脱液均购自武汉拓捷生物公司; Tris和甘氨酸购自国药集团化学试剂有限公司(上海); 动物麻醉剂(速眠新Ⅱ)购自中国动物保健品有限公司(北京), 其他试剂由中国人民解放军中部战区总医院医学实验科提供。

1.2   方法

1.2.1   KCs细胞悬液的制备

经肌肉注射速眠新Ⅱ(0.2 ml/kg)麻醉后, 对其进行消毒、开腹、门静脉暴露和固定插管并打开胸腔。根据Zeng等^[12]制备KCs细胞悬液的方法, 对下腔静脉结扎后, 快速切割、断裂部分肝脏, 用PBS冲洗两次。取肝悬液离心, 取上清液。充分悬浮后, 将上述肝细胞悬液移入含30%和60%细胞分离液的离心管中, 以800 g(20℃)缓升缓降离心20 min, 离心后可见乳白色细胞层。收集细胞层, 继续培养。

1.2.2   构建低温和冻融坏死的肿瘤细胞攻击KCs的细胞模型

模拟冻融治疗时体内KCs受到的主要攻击因素是低温和冻融坏死物质, 构建体外细胞模型。将浓度为1×10⁶/ml的KCs悬浮液用5 ml一次性塑料吸管分为不同的培养瓶, 每瓶加入5 ml。实验分为8组, 每组9瓶:(1)对照组:KCs正常培养37℃; (2)0℃组:模拟冻融治疗时冰球边缘温度, 将培养瓶置于0℃环境中20 min, 取出放回37℃孵化器。5 min后, 将培养瓶置于0℃环境中20 min, 再放入37℃培养箱中, 培养6 h后, 进行实验; (3)5℃低温组和10℃低温组:模拟冻融治疗时冰球边缘距离0.5 cm和2 cm的温度。实验方法与0℃组相同, 但放置培养瓶的温度环境不同。5℃组在5℃环境中放置2次20 min, 10℃组在10℃环境中放置2次20 min; (4)冻融坏死物质组:冻融治疗后第3天将治疗中心肿瘤组织(人肝癌HepG2细胞购于中国科学院上海科学院资源中心, 于中国人民解放军中部战区总医院医学实验科内进行传代培养)制成1%细胞悬液, 在KCs培养瓶中加入2 ml, 其余培养条件与对照组相同; (5)联合刺激组:按不同温度(0℃、5℃、10℃)放置的KCs培养瓶分为3组。各组再加入冻融肿瘤坏死细胞悬液, 其浓度与冻融坏死物质组相同, 实验方法分为0℃、5℃和10℃组。

1.2.3   干预措施

以上8组各设1个平行组。将PDTC加入培养基中, NF-κB抑制剂最终浓度为100 μmol/L。

1.2.4   KCs分泌功能的检测

参考文献中的方法^[13], 采用ELISA法检测KCs上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1β)和干扰素-γ(INF-γ)的浓度。各组采用ELISA法检测细胞培养液中的IFN-γ、IL-1β、TNF-α的浓度。

1.2.5   NF-κB蛋白测定

各组培养6 h后, 用Western blot法检测各组NF-κB蛋白的表达, 用定量软件处理系统分析靶带的吸光度值。Western blot检测方法如文献所述^[14]。用鼠抗NF-κB抗体(sc-109, Santa Cruz生物技术, 美国圣克鲁斯州)进行印迹检测, 计算靶带的吸光度值。

1.3   统计学方法

采用SPSS19.0统计学软件进行统计学分析。计数资料以均数±标准差()表示, 采用t检验及方差分析; 计量资料以率(%)表示, 采用χ²检验; 组间比较采用单因素方差分析; 组内比较采用Friedman检验, P < 0.05为差异有统计学意义。

2   结果

2.1   KCs分泌功能测试

(1) 无抑制剂组与对照组比较:低温组(0℃、5℃、10℃)和10℃冻融坏死物质组培养1 h时KCs细胞分泌炎性因子水平差异无统计学意义(P>0.05), 冻融坏死物质组与联合刺激组比较KCs细胞分泌炎性因子水平差异有统计学意义(P < 0.05), 10℃冻融坏死物质组与对照组比较KCs细胞分泌炎性因子水平差异有统计学意义(P < 0.05)。各组培养1 h, 与对照组比较(P < 0.01), 差异有统计学意义。(2)无抑制剂组KCs细胞分泌炎性因子水平与培养时间的相关性:随着培养时间的延长(1、2、3 h), 炎性因子的分泌水平显著升高, 差异有统计学意义(χ²=10.750, P=0.005)。(3)抑制剂组与对照组比较:各组KCs细胞分泌炎性因子水平比较(P>0.05), 差异无统计学意义; 组内KCs细胞分泌炎性因子水平比较, 差异无统计学意义(χ²=2.25, P=0.325)。(4)有抑制剂组和无抑制剂组KCs细胞分泌炎性因子水平比较, 两组在相同条件下(对照组除外)均有统计学意义(P < 0.01)。

KCs分泌功能结果显示, 用低温或冻融坏死物或联合刺激KCs后培养1 h, 炎性因子的分泌增加(P < 0.01), 低温和冻融坏死产物组的联合刺激具有叠加作用。此外, 随着培养时间的延长(1、3、6 h), 炎性因子的分泌水平显著升高(χ²=10.750, P=0.005), 有级联放大的趋势。在PDTC存在下, 8组间炎性因子的分泌水平差异无统计学意义(P=0.325)。延迟培养时间, 各组KCs细胞分泌炎性因子水平无变化, 见表 1~2。

表  1  无抑制剂组的KCs分泌功能测试结果

Table  1  Test results of secretion function of Kupffer cells (KCs) without inhibitor

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表  2  有抑制剂组的KCs分泌功能测试结果

Table  2  Test results of secretion function of KCs with inhibitor

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2.2   NF-κB蛋白表达

低温刺激对NF-κB蛋白的表达无显著影响, 而对照组与低温组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。联合刺激组和冻融坏死物质组NF-κB蛋白表达明显上调(P < 0.05), 差异有统计学意义。而抑制剂组NF-κB蛋白的表达无明显变化, 其线型几乎呈直线状, 见图 1~3。

图  1  无抑制剂时NF-κB蛋白的表达

Figure  1  Expression of NF-κB protein in group without inhibitor

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图  2  有抑制剂时对NF-κB蛋白表达的影响

Figure  2  Effect of inhibitor on expression of NF-κB protein

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图  3  NF-κB蛋白的表达

Figure  3  Expression of NF-κB protein

1: Control group; 2: 0℃; 3: 5℃; 4: 10℃; 5: Frozen necrosis; 6: 0℃+Frozen necrosis; 7: 5℃+Frozen necrosis; 8: 10℃+Frozen necrosis

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3   讨论

KCs凭其吞噬和分泌功能, 参与了肝脏多种重要的生理和病理过程, 如清除坏死细胞和组织碎片, 诱导炎性反应、参与脂质代谢、移植免疫等^[15-17]。KCs功能受内毒素、脂多糖、坏死组织或细胞、应激等多种因素的影响^[10]。活化的KCs能产生多种细胞因子, 包括TNF-α、IL-1β和INF-γ等, 对靶细胞产生杀伤作用, 从而发挥其生物学作用^[18]。冻融治疗主要利用温度急剧变化, 破坏肿瘤细胞, 同时对治疗区周围组织产生低温刺激, 诱发机体应激反应。而应激和坏死肿瘤细胞释放的如水解蛋白酶等细胞有害物均可引起KCs的变化^[19]。

KCs受到低温或冻融坏死物质刺激后, 可促进炎性因子的分泌, 如TNF-α、IL-1β和INF-γ, 这些炎性因子可诱导炎性细胞聚集、介导炎性反应和清除坏死细胞或组织碎片^[20], 这一反应过程可能是冻融治疗后残存肿瘤的一个杀伤机制。此外, 本研究还发现, 在培养瓶中加入NF-κB抑制剂后, 低温组、冻融坏死物质组和联合刺激组的炎性细胞因子水平均无变化, 说明用NF-κB抑制剂可以抑制炎性因子的分泌过程。同时, 还发现TNF-α、IL-1β和INF-γ的浓度与KCs上清液中NF-κB蛋白表达呈正相关, 所以冻融治疗后KCs的分泌功能可能通过NF-κB信号通路调控。

NF-κB是一个转录因子家族, 调控大量参与细胞存活、炎性反应和免疫反应等重要生理过程的基因。最近有研究表明, NF-κB的组成型表达与多种类型的癌症有关^[21]。NF-κB信号通路也是炎性反应相关的癌症发生的重要因素^[22]。本研究通过对NF-κB信号通路相关蛋白的检测, 探讨了KCs诱导炎性反应的机制。NF-κB是细胞内重要的核转录因子, 是细胞免疫和炎性反应的重要组成部分^[23], 它参与多种基因的表达和调控^[24]。关于KCs活化的信号转导途径, 认为NF-κB是调节KCs活化的关键因素^[25], NF-κB在某些细胞信息转录调控中起着关键作用^[26], 它是细胞活化的标志, 也是激活炎性反应的重要因素^[27]。有研究证实, NF-κB信号通路是肿瘤治疗的潜在靶点^[28]。如果这一信号通路在冻融治疗引起的免疫功能变化中发挥类似作用, 将有助于探讨冻融治疗后免疫功能变化的机制。其最直接的判断方法即阻断NF-κB信号通路。吡咯烷二硫代氨基甲酸酯在NF-κB活化通道的不同水平发挥抑制NF-κB蛋白表达的作用, 从而阻断NF-κB信号通路, 阻断是否成功可以通过检测NF-κB信号通路中的通路终末蛋白NF-κB蛋白的表达情况判断。

在KCs培养瓶中加入冻融坏死物质, 其中含有细胞毒素等刺激信号, 这些信号可与KCs膜表面受体结合, 如与清道夫受体(scavenger receptor, SR)结合, 被吞噬到KCs内; 再经过多级级联反应, 使NF-κB的抑制蛋白(IKB)的上游激酶IKB激酶(IKB kinse, IKK)磷酸化而激活, IKK使IKB降解。P50有核定位信号, 当失去了IKB的束缚后, P50会携载RelA(P65)向核内迁移, P65与细胞核内基因启动子或增强子区域上的顺势反应元件结合, 从而调控靶基因的转录, 诱导NF-κB mRNA的产生, 最后转录、产生和释放各种细胞因子(如TNF-α、IL-1β等)^[29]。本研究检测结果提示加入冻融坏死物质后, NF-κB蛋白表达上调, 炎性因子分泌增加, 说明NF-κB信号通路的存在; 而加入PDTC后, PDTC作为一种抗氧化剂, 可以在NF-κB活化通道的不同水平发挥抑制NF-κB蛋白表达的作用, 如阻止上游IKK磷酸化, 从而阻止NF-κB信号通路, 抑制NF-κB蛋白表达, 导致炎性因子分泌减少。反向证明冻融治疗后KCs的变化可能通过NF-κB信号通路发挥作用。

综上所述, 冻融治疗可以改变KCs周围的微环境, 刺激KCs分泌细胞因子的功能, 从而诱导炎性反应, 清除肿瘤细胞。另外还证实KCs分泌功能变化可能是通过NF-κB信号通路转导的。