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乏氧条件下HIF-1α通过上调PD-L1促进鼻咽癌恶性发展的机制

蒋豆豆, 董佳文, 胡德胜, 周亚娟

蒋豆豆, 董佳文, 胡德胜, 周亚娟. 乏氧条件下HIF-1α通过上调PD-L1促进鼻咽癌恶性发展的机制[J]. 肿瘤防治研究, 2021, 48(6): 570-575. DOI: 10.3971/j.issn.1000-8578.2021.20.1543
引用本文: 蒋豆豆, 董佳文, 胡德胜, 周亚娟. 乏氧条件下HIF-1α通过上调PD-L1促进鼻咽癌恶性发展的机制[J]. 肿瘤防治研究, 2021, 48(6): 570-575. DOI: 10.3971/j.issn.1000-8578.2021.20.1543
JIANG Doudou, DONG Jiawen, HU Desheng, ZHOU Yajuan. Mechanism of HIF-1α Promoting Malignant Development of Nasopharyngeal Carcinoma by Upregulating PD-L1 Under Hypoxic Conditions[J]. Cancer Research on Prevention and Treatment, 2021, 48(6): 570-575. DOI: 10.3971/j.issn.1000-8578.2021.20.1543
Citation: JIANG Doudou, DONG Jiawen, HU Desheng, ZHOU Yajuan. Mechanism of HIF-1α Promoting Malignant Development of Nasopharyngeal Carcinoma by Upregulating PD-L1 Under Hypoxic Conditions[J]. Cancer Research on Prevention and Treatment, 2021, 48(6): 570-575. DOI: 10.3971/j.issn.1000-8578.2021.20.1543

乏氧条件下HIF-1α通过上调PD-L1促进鼻咽癌恶性发展的机制

基金项目: 

国家自然科学基金 81803065

详细信息
    作者简介:

    蒋豆豆(1995-),女,硕士,主要从事肿瘤生物学研究

    董佳文(1997-),女,硕士,主要从事肿瘤生物学研究

    通讯作者:

    胡德胜(1963-),男,本科,主任医师,主要从事肿瘤放射治疗的临床及科研工作,E-mail: hds_005@163.com

    周亚娟(1985-),女,博士,副主任医师,主要从事肿瘤放射治疗的临床及科研工作,E-mail: whu-yajuan@163.com

    *: 并列第一作者

  • 中图分类号: R739.62

Mechanism of HIF-1α Promoting Malignant Development of Nasopharyngeal Carcinoma by Upregulating PD-L1 Under Hypoxic Conditions

Funding: 

National Natural Science Foundation of China 81803065

More Information
  • 摘要:
    目的 

    探讨乏氧条件下HIF-1α通过上调PD-L1促进鼻咽癌恶性发展的机制。

    方法 

    选取人类鼻咽癌细胞系CNE2细胞进行实验。设置常氧组(20%O2)、乏氧组(1%O2)、HIF-1α-siRNA+乏氧组和NC-siRNA+乏氧组。MTT实验检测各组细胞增殖率;流式细胞术检测各组细胞凋亡;RT-PCR检测各组细胞中HIF-1α、STAT3和PD-L1 mRNA表达的变化;Western blot检测不同处理条件下各组细胞HIF-1α、STAT3和PD-L1蛋白表达的变化及STAT3磷酸化情况。

    结果 

    MTT实验显示,乏氧组和转染细胞增殖率显著高于常氧组(P=0.000),HIF-1α-siRNA+乏氧组的细胞增殖率明显低于常氧组、乏氧组和NC-siRNA+乏氧组(P=0.000)。流式分析显示,HIF-1α-siRNA+乏氧组的细胞凋亡率显著高于其他三组(P=0.001)。RT-PCR检测显示,HIF-1α-siRNA+乏氧组的HIF-1α、PD-L1和STAT3 mRNA水平显著低于乏氧组和NC-siRNA+乏氧组。蛋白印迹结果显示,HIF-1α、PD-L1和STAT3蛋白表达趋势与mRNA分子水平趋势一致。HIF-1α-siRNA+乏氧组pSTAT3蛋白水平也显著低于乏氧组和NC-siRNA+乏氧组(P=0.001)。

    结论 

    乏氧微环境下HIF-1α有可能通过STAT3上调PD-L1表达,进而促进癌细胞免疫逃逸,导致鼻咽癌恶性发展。

     

    Abstract:
    Objective 

    To explore the mechanism of HIF-1α promoting malignant development of nasopharyngeal carcinoma by upregulating PD-L1 expression under hypoxic conditions.

    Methods 

    CNE2 cells were divided into normoxia (20%O2), hypoxia (1%O2), HIF-1α-siRNA+hypoxia and NC-siRNA+hypoxia groups. Cell proliferation, apoptosis, the mRNA levels of HIF-1α, STAT3 and PD-L1, the protein levels of HIF-1α, PD-L1, STAT3 and STAT3 phosphorylation were detected by MTT assay, flow cytometry, RT-PCR and Western blot, respectively.

    Results 

    Cell proliferation of hypoxia group was significantly higher than that of normoxia group (P=0.000). The cell proliferation rate of HIF-1α-siRNA+hypoxia group was significantly lower than those in other groups (P=0.000). The apoptosis rate of HIF-1α-siRNA+hypoxia group was remarkably higher than those in other groups (P=0.001). RT-PCR detection showed that the mRNA levels of HIF-1α, PD-L1 and STAT3 in the HIF-1α-siRNA+hypoxia group were significantly lower than those in hypoxia group and NC-siRNA+hypoxia group. The protein expression of HIF-1α, PD-L1 and STAT3 showed similar tendency in Western blot assays compared with the mRNA levels. The pSTAT3 protein expression level in HIF-1α-siRNA+hypoxia group was significantly lower than those in hypoxia group and HIF-1α-siRNA+hypoxia group (P=0.001).

    Conclusion 

    Under hypoxic microenvironment, HIF-1α may up-regulate the expression of PD-L1 through STAT3, thereby promoting the immune escape of cancer cells, leading to the malignant development of nasopharyngeal carcinoma.

     

  • 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我国以及东南亚地区常见的头颈部恶性肿瘤之一,死亡率约为1.74/100 000[1]。鼻咽癌治疗后复发病例占治疗失败病例的30%,复发的鼻咽癌往往具有肿瘤乏氧[2]、肿瘤侵袭能力增强、治疗前贫血[3]等更加恶劣的病理学表现,从而加大复发后的治疗难度。研究表明,鼻咽癌复发患者5年内生存率仅为30%[4]。乏氧诱导因子-1α(hypoxia induce factor-1α, HIF-1α)是机体应对乏氧的主要效应因子,已经被证实与肿瘤缺氧、侵袭能力增强等细胞生物学行为密切相关[5]。程序死亡受体-配体1(programmed death ligand 1, PD-L1)是程序性死亡受体1(programmed death 1, PD-1)的配体之一,可以抑制T细胞的活化,诱导肿瘤患者体内T细胞凋亡从而导致肿瘤细胞免疫逃逸[6]。临床研究表明在口腔癌和肺癌中PD-L1的表达与HIF-1α有关[7-8]。因此,乏氧诱导的鼻咽癌恶化很可能与HIF-1α调节PD-L1的表达相关,但具体调控机制尚未明确。本实验以鼻咽癌细胞为研究对象,通过在乏氧条件下沉默HIF-1α基因,检测细胞增殖和细胞凋亡率,研究了乏氧条件下鼻咽癌中HIF-1α对于鼻咽癌细胞生物学行为的影响,并且初步探讨鼻咽癌细胞中HIF-1α通过上调PD-L1促进鼻咽癌恶性发展的相关分子机制。

    人类鼻咽癌细胞系CNE2(低分化癌),由中山肿瘤防治中心赠予。

    RPMI 1640培养基购自美国Hyclone公司,胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)、青霉素-链霉素双抗浓缩液(×100)、无血清培养基Opti-MEM、胰酶(Trypsin-EDTA)购自美国Gibco公司;核糖核酸酶抑制剂、MTT细胞增殖检测剂购自美国Sigma公司;Triton-X 100购自北京中杉金桥生物技术有限公司;HIF-1α小鼠单克隆抗体(93kD)、STAT3兔单克隆抗体(88kD)、PSTAT3兔单克隆抗体(88kD)、PD-L1兔单克隆抗体(40~45kD)、兔多抗GAPDH(37kD)均购自英国Abcam公司;RNA提取试剂TRIzol reagent、LipofectamineTM 2000购自美国Invitrogen公司;反转录试剂盒、PCR Master Mix试剂盒购自加拿大Fermentas公司;siRNA及PCR目标基因引物的合成由北京擎科新业生物技术有限公司提供。

    采用10%FBS、1%青霉素和链霉素的RPMI 1640培养基培养细胞。取对数生长期、生长状态良好的CNE2细胞,进行细胞计数,并以每孔2×105个细胞接种于6孔板,37℃、5%CO2培养箱中培养。设常氧组、乏氧组、HIF-1α-siRNA+乏氧组、NC-siRNA+乏氧组四组进行实验。常氧组的细胞在20%O2中培养,乏氧组在1%O2中培养,HIF-1α-siRNA+乏氧组的细胞在1%O2中培养并转染HIF-1α-siRNA,NC-siRNA+乏氧组在1%O2中培养并转染NC-siRNA。按照脂质体LipofectamineTM2000转染试剂说明书进行细胞转染,将根据HIF-1α序列设计筛选的HIF-1α-siRNA转染至CNE2细胞,同时另设一组CNE2细胞转染无意义的干扰序列NC-siRNA作为对照。培养48 h后进行后续实验,转染序列见表 1

    表  1  转染序列
    Table  1  Transfection sequence
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    按照不同的条件处理细胞以后,弃去培养基停止培养,加入TRIzol提取总RNA,按照反转录试剂盒说明书将RNA反转录成cDNA,PCR产物通过1.2%琼脂糖凝胶电泳分离,于凝胶成像仪中成像。同时按照荧光定量PCR试剂盒说明书检测mRNA水平。反应条件为:50℃ 2 min,95℃ 10 min;95℃ 30 s,60℃ 30 s,40个循环。引物序列见表 2。最终数据采用2-ΔΔCt方法进行分析(检测siRNA敲低效率)。通过RT-PCR检测HIF-1α、PD-L1及STAT3分子的mRNA表达水平。

    表  2  引物序列及扩增片段长度
    Table  2  Primer sequence and amplified fragment length
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    将各组细胞按照不同条件处理后,弃去培养基终止培养后,用0.25%的胰酶消化,按照每孔5×104个/毫升接种至96孔板,按照不同条件培养过夜后,每孔加入10 μl MTT,37℃孵育4 h后,加入150 μl DMSO,最后用酶标仪测量568 nm波长处的OD值,细胞存活率(%)=(实验组OD均值/对照组OD均值)×100%。

    将各组不同细胞按不同条件处理后,48 h收集各组细胞,按AnnexinV-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒说明书进行检测,加入Bind Buffer混匀,反应15 min后加入Annexin-APC检测试剂混匀,最后上流式细胞仪检测。

    按照不同条件处理细胞各组细胞后,弃去培养基终止培养,每皿加入100 μl细胞裂解液(PMSF: 裂解液=1:100)裂解细胞,冰上裂解30 min后收集裂解的细胞,按照BSA试剂盒测量提取的蛋白浓度。将提取的蛋白用5×蛋白上样缓冲液混合后,在沸水中煮沸变性。样品用10%分离胶或者8%分离胶以及5%浓缩胶进行电泳分离,电转、封闭之后,4℃孵育一抗过夜(GADPH: 1:1 000,STAT3: 1:1 500, PSTAT3: 1:200 000, HIF-1α: 1:1 000, PD-L1: 1:1 000),第二日用HRP标记羊抗兔二抗室温孵育2 h,最后用凝胶成像仪成像,BandScan5.0分析胶片灰度值。

    数据应用均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析。实验数据采用SPSS17.0软件进行分析;双侧检验P < 0.05为差异有统计学意义。

    我们针对HIF-1α设计合成了三条不同的siRNA序列,筛选出其中敲低效率最高的一条,即HIF-1α-siRNA-2进行后续实验,见图 1A。MTT实验结果显示乏氧条件下细胞增殖率显著大于常氧组(均P=0.000),见图 1B。与常氧组相比,HIF-1α-siRNA+乏氧显著降低了细胞增殖率(P=0.000);与NC-siRNA+乏氧组相比,HIF-1α-siRNA+乏氧也显著降低了细胞增殖(P=0.000)。由此可得,乏氧条件下HIF-1α在CNE2的细胞增殖中发挥了重要作用。

    图  1  转染HIF-1α-siRNA后CNE2细胞对HIF-1α基因的沉默效率(A)和MTT检测不同处理条件下CNE2细胞的增殖水平(B)
    Figure  1  Silencing efficiency of HIF-1α in CNE2 cells(A) and proliferation of CNE2 cells under different treatment conditions detected by MTT(B)
    ***: P < 0.001.

    流式细胞术显示,乏氧条件下细胞凋亡率与常氧培养条件下细胞凋亡率无明显差异。相比于乏氧组的细胞,乏氧条件下转染HIF-1α-siRNA后显著增加了细胞凋亡率(P=0.000)。此外,HIF-1α-siRNA+乏氧组的细胞凋亡率也明显大于NC-siRNA+乏氧组(P=0.001),见图 2。实验结果提示靶向沉默HIF-1α基因能够促进人鼻咽癌细胞CNE2的凋亡。

    图  2  流式细胞术检测不同处理条件下CNE2细胞的凋亡水平
    Figure  2  Apoptosis of CNE2 cells under different treatment conditions detected by flow cytometry

    RT-PCR检测显示,乏氧组的HIF-1α mRNA水平显著高于常氧组(P=0.004),HIF-1α-siRNA转染后CNE2细胞HIF-1α mRNA水平显著下降,显著低于乏氧组(P=0.000)和NC-siRNA+乏氧组(P=0.000),显示转染成功,见图 3。HIF-1α-siRNA+乏氧组的PD-L1 mRNA水平显著低于乏氧组(P=0.000)和NC-siRNA+乏氧组(P=0.000),显示HIF-1α mRNA水平与PD-L1 mRNA水平呈正比。此外,乏氧组的STAT3 mRNA表达水平相比常氧组显著上升(P=0.009),HIF-1α-siRNA+乏氧组的STAT3 mRNA水平显著低于乏氧组(P=0.001)和NC-siRNA+乏氧组(P=0.001),见图 4。结果表明HIF-1α mRNA水平与PD-L1 mRNA水平成正相关,且STAT3可能是HIF-1α正性调控PD-L1的关键信号因子。

    图  3  RT-PCR检测CNE2细胞中HIF-1α、PD-L1及STAT3的表达
    Figure  3  HIF-1α, PD-L1 and STAT3 expression in CNE2 cells detected by RT-PCR
    1: Normoxia; 2: Hypoxia; 3: HIF-1α-siRNA+Hypoxia; 4: NC-siRNA+Hypoxia.
    图  4  不同条件下CNE2细胞中HIF-1α(A)、PD-L1(B)及STAT3(C)mRNA表达水平的变化
    Figure  4  HIF-1α(A), PD-L1(B) and STAT3(C) mRNA expression in CNE2 cells under different conditions
    **: P < 0.01; ***: P < 0.001; 1: Normoxia; 2: Hypoxia; 3: HIF-1α-siRNA+Hypoxia; 4: NC-siRNA+Hypoxia.

    Western blot检测结果显示,乏氧组的HIF-1α蛋白水平显著高于常氧组(P=0.004),HIF-1α-siRNA转染后的CNE2细胞HIF-1α分子蛋白水平显著下降,显著低于乏氧组(P=0.001)和NC-siRNA+乏氧组(P=0.001)。同时,HIF-1α-siRNA+乏氧组的PD-L1蛋白水平显著低于乏氧组(P=0.017)和NC-siRNA+乏氧组(P=0.0017),显示HIF-1α分子蛋白水平与PD-L1蛋白水平成正比。此外,相比常氧组,乏氧组的STAT3和pSTAT3蛋白表达水平均显著上升(P=0.011),HIF-1α-siRNA+乏氧组的STAT3蛋白水平显著低于乏氧组(P=0.009)和NC-siRNA+乏氧组(P=0.001),HIF-1α-siRNA+乏氧组的pSTAT3蛋白水平显著低于乏氧组和NC-siRNA+乏氧组(均P < 0.001),见图 5~6。实验结果表明,乏氧条件下,随着HIF-1α诱导PD-L1的高表达,STAT3磷酸化水平也增加。反之,HIF-1α的靶向沉默抑制了PD-L1的表达和STAT3磷酸化水平。我们认为HIF-1α诱导PD-L1表达上调可能通过活化STAT3实现。

    图  5  Western blot检测CNE2细胞中HIF-1α, PD-L1, STAT3及pSTAT3蛋白的表达
    Figure  5  HIF-1α, PD-L1, STAT3 and pSTAT3 protein expression in CNE2 cells detected by Western blot
    1: Normoxia; 2: Hypoxia; 3: HIF-1α-siRNA+Hypoxia; 4: NC-siRNA+Hypoxia.
    图  6  不同条件下CNE2细胞中HIF-1α(A)、PD-L1(B)、STAT3(C)及pSTAT3(D)蛋白表达水平的变化
    Figure  6  HIF-1α(A), PD-L1(B), STAT3(C) and pSTAT3(D) proteins expression in CNE2 cells under different conditions
    *: P < 0.05; **: P < 0.01; ***: P < 0.001; 1: Normoxia; 2: Hypoxia; 3: HIF-1α-siRNA+Hypoxia; 4: NC-siRNA+Hypoxia.

    鼻咽癌是我国最常见的头颈部恶性肿瘤之一,传统的治疗方法难以根治。乏氧在肿瘤微环境中非常常见,且能影响恶性肿瘤的生理状况。HIF-1α是乏氧环境下调控基因的重要转录因子[8]。研究表明,HIF-1α在包括乳腺癌[9]、鼻咽癌及结肠癌等多种人类肿瘤中过度表达,且HIF-1α高表达往往与恶性肿瘤患者的不良预后有关。有研究证明原花青素可以通过降低HIF-1α从而抑制鼻咽癌细胞生长[10]。然而,HIF-1α在鼻咽癌中的具体机制尚不明确。本研究发现,乏氧组HIF-1α高表达下的高增殖率和低凋亡率可被siRNA-HIF-1α转染有效逆转。这些结果证明HIF-1α表达可以促使乏氧条件下鼻咽癌的恶性进展。

    随着免疫治疗的发展,PD-L1的表达水平与鼻咽癌发展开始得到密切关注。PD-L1往往在肿瘤细胞表面高表达,通过与PD-1的结合抑制T细胞活化,促进肿瘤细胞免疫逃逸。研究表明乏氧条件下HIF-1α可能通过调节PD-L1,造成肿瘤细胞免疫耐受,促进癌症恶性发展[11-14]。最新研究发现鼻咽癌白人患者中肿瘤细胞上PD-L1表达与不良结果相关[15]。本研究发现,鼻咽癌细胞中HIF-1α的表达与PD-L1的表达呈显著正相关。除此之外,乏氧条件下,鼻咽癌细胞中STAT3 mRNA和蛋白水平显著高于常氧组,而转染siRNA-HIF-1α逆转了这一现象,同时降低了STAT3的磷酸化水平。已有研究报道STAT3是介导PD-L1表达的调控因子[16],而伊卡利汀可以通过抑制STAT3磷酸化抑制鼻咽癌细胞CNE2的增殖、迁移和侵袭[17]。因此,PD-L1可能是乏氧诱导鼻咽癌恶性进展的重要原因,并且涉及STAT3的活化,这与Xing等[18]研究结论一致。

    PD-L1免疫治疗可能给鼻咽癌治疗带来新的治疗策略。PD-L1抗体阿特珠单抗,Durvalumab已可以用来治疗非小细胞肺癌和膀胱癌[19]。PD1免疫抑制剂联合化学疗法作为转移性鼻咽癌的一线治疗可以缓解91%患者的病情,34%复发鼻咽癌患者的病情[20],IFNβ和抗PD-1的组合可以增强NK细胞对鼻咽癌细胞的细胞毒性[21],但是尚未有临床报导PD-L1抑制剂对鼻咽癌的治疗作用。

    PD-L1是鼻咽癌患者预后的独立影响因素[22],结合本研究发现,PD-L1在免疫耐受中的调控作用将会给鼻咽癌治疗带来新的方向,PD-L1有望为鼻咽癌免疫疗法提供新的分子靶标。另外,本研究在评估PD-L1的表达与临床鼻咽癌患者的相关性,验证PD-L1抑制剂对鼻咽癌的治疗作用等实验方面还待展开,如何使鼻咽癌免疫治疗更优化,需要我们结合更多的实验和大数据分析,进一步探索PD-L1影响鼻咽癌的相关机制,考察以PD-L1为靶点的治疗方案。

    Competing interests: The authors declare that they have no Competing interests.
    作者贡献:
    蒋豆豆:实验操作及论文撰写
    董佳文:实验操作
    胡德胜、周亚娟:实验设计及指导
  • 图  1   转染HIF-1α-siRNA后CNE2细胞对HIF-1α基因的沉默效率(A)和MTT检测不同处理条件下CNE2细胞的增殖水平(B)

    Figure  1   Silencing efficiency of HIF-1α in CNE2 cells(A) and proliferation of CNE2 cells under different treatment conditions detected by MTT(B)

    图  2   流式细胞术检测不同处理条件下CNE2细胞的凋亡水平

    Figure  2   Apoptosis of CNE2 cells under different treatment conditions detected by flow cytometry

    图  3   RT-PCR检测CNE2细胞中HIF-1α、PD-L1及STAT3的表达

    Figure  3   HIF-1α, PD-L1 and STAT3 expression in CNE2 cells detected by RT-PCR

    图  4   不同条件下CNE2细胞中HIF-1α(A)、PD-L1(B)及STAT3(C)mRNA表达水平的变化

    Figure  4   HIF-1α(A), PD-L1(B) and STAT3(C) mRNA expression in CNE2 cells under different conditions

    图  5   Western blot检测CNE2细胞中HIF-1α, PD-L1, STAT3及pSTAT3蛋白的表达

    Figure  5   HIF-1α, PD-L1, STAT3 and pSTAT3 protein expression in CNE2 cells detected by Western blot

    图  6   不同条件下CNE2细胞中HIF-1α(A)、PD-L1(B)、STAT3(C)及pSTAT3(D)蛋白表达水平的变化

    Figure  6   HIF-1α(A), PD-L1(B), STAT3(C) and pSTAT3(D) proteins expression in CNE2 cells under different conditions

    表  1   转染序列

    Table  1   Transfection sequence

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    表  2   引物序列及扩增片段长度

    Table  2   Primer sequence and amplified fragment length

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  • 期刊类型引用(1)

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出版历程
  • 收稿日期:  2021-01-03
  • 修回日期:  2021-03-03
  • 网络出版日期:  2024-01-12
  • 刊出日期:  2021-06-24

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