0   引言

近年来，我国喉癌发病率及死亡率不断上升，已成为头颈部最常见的恶性肿瘤之一^[1]，晚期喉癌术后同期放化疗的5年生存率为68.2%，单纯放疗的5年生存率仅为48.9%^[2]。放疗在喉鳞癌的治疗中起到至关重要的作用^[3]。放射抵抗是导致放疗失败的重要原因^[4]。

UBE2N是泛素交联酶E2家族的成员之一。泛素交联酶E2家族参与泛素-蛋白酶体复合通路（ubiquitin-proteasome pathway, UPP）对底物蛋白的泛素化降解^[5]。泛素-蛋白酶体复合通路在调控细胞周期、增殖、信号转导、DNA损伤修复、免疫应答等方面都发挥着重要作用^[6]。UBE2N是DNA损伤修复通路的成员^[7]，DNA损伤后，UBE2N与泛素连接酶RNF8及RNF168结合后，促进DNA损伤反应中BRCA1及H2AX的泛素化修饰，从而促进下游DNA损伤反应的进行^[8]。研究发现泛素交联酶UBE2N可能调控肿瘤细胞的放疗敏感度^[9]。本研究沉默喉鳞癌hep-2细胞中UBE2N的表达，通过CCK8法、流式细胞术及克隆形成等实验，验证沉默UBE2N表达后对喉鳞癌细胞放射敏感度的影响，为明确UBE2N在调控喉鳞癌细胞放射敏感度中的作用提供实验依据。

1   材料与方法

1.1   实验材料

DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；UBE2N siRNA沉默序列和阴性对照序列均由上海吉玛公司合成。RNA反转录试剂盒、PCR扩增试剂盒购自日本TaKaRa公司；蛋白裂解液、蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、细胞周期检测试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒均购自南通碧云天生物技术研究所；内参GAPDH购自苏州GenePharma公司。GAPDH抗体、β-actin抗体、UBE2N抗体及各HRP-标记二抗购自英国Abcam公司；ECL化学发光试剂盒购自美国Thermo公司。Lipofectamine 3000购自美国Invitrogen公司；CCK8试剂盒购自日本同仁公司。流式细胞仪购自美国BD公司；荧光定量PCR仪、酶标仪、凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司。相机购自日本Canon公司。

1.2   实验方法

1.2.1   细胞培养

人喉鳞癌hep-2细胞购自中国科学院上海细胞库，用含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃含5%CO₂的细胞培养箱中培养。

1.2.2   UBE2N RNA沉默质粒转染

实验分为UBE2N干扰组（UBE2N-siRNA）和阴性对照组（NC），UBE2N RNA沉默靶序列为：5′-AUCCAGAUGAUCCAUUAGCAATT-3′，阴性对照序列为：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。收集细胞，调整细胞密度至2×10⁵/ml，接种于6孔板。待细胞贴壁生长后，按照Lipofectamine 3000说明书操作转染siRNA，转染24、48、72、96 h后，收集细胞进行后续相关实验。

1.2.3   qPCR实验

收集细胞（约1×10⁶个），按照RNA反转录试剂盒说明书操作提取RNA。取总RNA 2μg进行反转录反应，然后进行qPCR反应，PCR反应条件：95℃预变性1 min，95℃变性15 s，60℃退火1 min，72℃延伸1min，40个循环。UBE2N引物序列为：F: 5′-GCGTTTGCTGGCAGAACCAG-3′，R: 5′-CTCAAAGGGGGAATCCTGAGGG-3′；GAPDH引物序列为：F: 5′-CCAACCGCGAGAAGATGA-3′，R: 5′-CCAGAGGCGTACAGGGATAG-3′。以GAPDH为内参，按照2^-ΔΔCt法计算UBE2N相对表达量。

1.2.4   Western blot实验

收集细胞(约1×10⁶个)，按照试剂盒说明书操作提取蛋白，采用BCA法进行蛋白定量。取10 μg总蛋白用10% SDS-PAGE胶电泳，转膜后置于5%脱脂奶粉中室温封闭2 h。一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h，采用ECL化学发光试剂盒显影。以ImagePro Plus 6.0图像分析软件计算灰度值，将内参蛋白与目的蛋白两者灰度值的比值作为目的蛋白的表达量。

1.2.5   CCK8增殖实验

hep-2细胞经siRNA转染，并用0、2、4、6、8 Gy X线照射或不照射，收集细胞（约1×10⁶个），以每孔3 000个细胞铺到96孔板中，培养24、48、72和96 h后分别向对应的细胞中加入CCK8，将96孔培养板置于37℃恒温箱孵育1 h，用酶标仪测450 nm处吸光度值。

1.2.6   细胞凋亡的测定

hep-2细胞经siRNA转染，并用0、2、4、6、8 Gy X线照射后，收集细胞（约1×10⁶个），预冷PBS洗3次。按照细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，采用Annexin V/PI双染，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.7   细胞周期的测定

hep-2细胞经siRNA转染，并用0、2、4、6、8 Gy X线照射后，收集细胞（约1×10⁶个），预冷PBS洗3次。70%的冷乙醇4℃固定过夜。按照细胞周期检测试剂盒说明书操作染色，采用流式细胞仪检测细胞周期。

1.2.8   细胞克隆形成实验

hep-2细胞经siRNA转染，收集细胞铺到6孔板中，每孔2 000个细胞。每组3孔平行样本。并用0、2、4、6、8 Gy X线照射后，静置于37℃培养箱中培养14天。14天后培养板中出现肉眼可见克隆时，终止培养，用PBS轻轻冲洗2~3遍，1%结晶紫染色20 min，除去染色液，纯水轻轻洗涤2~3遍，晾干，用相机拍照留底，在显微镜下计数克隆个数，≥50个的细胞团作为一个克隆。根据克隆形成计数结果计算每组细胞克隆形成率。

1.3   统计学方法

使用SPSS 22.0软件分析数据。以上所有实验至少重复三次，数据结果以（x±s）表示，通过配对样本t检验进行计算分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

2   结果

2.1   UBE2N siRNA沉默效果检测

转染48 h后qPCR检测结果显示：UBE2N-siRNA组UBE2N mRNA表达（0.459±0.044）明显受到抑制，与NC组（1.000）比较，差异有统计学意义（F=0.10, P=0.01），见图 1A。转染72 h后Western blot结果显示：UBE2N siRNA显著抑制了UBE2N蛋白水平，见图 1B。上述结果表明UBE2N siRNA能够有效抑制hep-2细胞UBE2N表达。

图  1  qPCR和Western blot法检测siRNA沉默UBE2N后UBE2N mRNA(A)和蛋白水平(B)

Figure  1  UBE2N mRNA(A) and protein(B) expression detected by qPCR and Western blot after UBE2N siRNA transfection

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2.2   沉默UBE2N促进hep-2细胞增殖

CCK8检测结果显示：经siRNA沉默24 h后, UBE2N-siRNA组和NC组细胞活力指数分别为（0.31±0.02）和（0.26±0.02）（P=0.042）；48 h后, 细胞活力指数分别为（0.49±0.10）和（0.29±0.02）（P=0.037）；72 h后, 细胞活力指数分别为（0.35±0.00）和（0.23±0.02）（P=0.003）；96 h后, 细胞活力指数分别为（0.27±0.03）和（0.20±0.00）（P=0.009）。说明沉默UBE2N显著提高hep-2细胞增殖能力，见图 2。

图  2  CCK8检测沉默UBE2N后hep-2细胞增殖情况

Figure  2  Effects of UBE2N silence on hep-2 cell proliferation detected by CCK8 assay

*: P < 0.05; **: P < 0.01, compared with NC group

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2.3   沉默UBE2N促进辐射后hep-2细胞增殖

经0、2、4、6、8 Gy射线照射48 h后，CCK8法结果显示：4、6 Gy射线照射后，UBE2N-siRNA组hep-2细胞增殖能力显著高于NC组（F_4Gy=0.27, P_4Gy=0.04; F_6Gy=0.63, P_6Gy=0.03），见图 3。提示沉默UBE2N会增强喉鳞癌细胞放射抵抗。

图  3  CCK8检测沉默UBE2N后hep-2细胞辐射后细胞增殖情况

Figure  3  Effect of UBE2N silence on proliferation of hep-2 cells detected by CCK8 assay after UBE2N siRNA transfection and different doses of irradiation

*: P < 0.05, compared with NC group

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2.4   细胞周期实验结果

经0、2、4、6、8 Gy射线照射后，NC组和UBE2N-siRNA组G1期细胞比例差异无统计学意义（均P > 0.05）；未经射线照射（0 Gy），UBE2N-siRNA组G₂期细胞比例明显高于NC组（P=0.043）；但经2、6 Gy射线照射后，UBE2N-siRNA组G₂期细胞比例明显低于NC组（均P < 0.05）；经0、4、6 Gy射线照射后，UBE2N-siRNA组S期细胞比例明显高于NC组（均P < 0.05），见图 4、表 1。结果表明经辐射处理后，沉默UBE2N会促进DNA合成，并部分解除G₂阻滞，提示沉默UBE2N会增强喉鳞癌细胞放射抵抗。

图  4  流式细胞术检测沉默UBE2N基因对辐射后hep-2细胞周期的影响

Figure  4  Effects of UBE2N silence on cell cycle of hep-2 cells detected by flow cytometry after UBE2N siRNA transfection and different doses of irradiation

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表  1  沉默UBE2N对经X射线处理后的hep-2细胞周期的影响

Table  1  Effects of UBE2N silence on cell cycle of hep-2 cells after X-ray treatment

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2.5   细胞凋亡实验结果

沉默UBE2N并经0、2、4、6、8 Gy射线照射后，Annexin V/PI双染法结果显示：UBE2N干扰组细胞总凋亡率（早期凋亡+晚期凋亡）显著低于NC组（均P < 0.05），见图 5、表 2。结果证明沉默UBE2N降低辐射诱导的喉鳞癌细胞凋亡。

图  5  流式细胞术检测沉默UBE2N对辐射后hep-2细胞凋亡的影响

Figure  5  Effects of UBE2N silence on apoptosis of hep-2 cells detected by flow cytometry after UBE2N siRNA transfection and different doses of irradiation

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表  2  沉默UBE2N对X射线诱导的细胞凋亡的影响

Table  2  Effects of UBE2N silence on X-ray-induced cell apoptosis

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2.6   克隆形成实验结果

沉默UBE2N并经0、2、4、6 Gy射线照射后，UBE2N-siRNA组细胞克隆形成能力显著强于NC组（均P < 0.05），见图 6、表 3。提示沉默UBE2N会增强喉鳞癌细胞放射抵抗。

图  6  克隆形成实验检测沉默UBE2N对辐射后hep-2细胞克隆形成能力的影响

Figure  6  Effects of UBE2N silence on clone formation of hep-2 cells detected by clone formation assay after UBE2N siRNA transfection and different doses of irradiation

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表  3  沉默UBE2N对X射线处理后的细胞克隆形成能力的影响

Table  3  Effects of UBE2N silence on cell clone formation ability after X-ray treatment

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3   讨论

近年研究显示，泛素交联酶与肿瘤放疗抵抗密切相关。研究发现使用一种特异性抑制小分子抑制剂NSC697923抑制UBE2N后，P53及JNK通路激活，神经母细胞瘤细胞、弥漫性大B淋巴瘤细胞的增殖减慢并促进其凋亡，故而推测UBE2N可能是这两种肿瘤的潜在治疗靶点之一^[10-11]。张喜梅等在人喉鳞癌细胞株中发现UBE2N在放疗抵抗株hep-2R中表达明显高于亲本细胞hep-2，提示泛素交联酶UBE2N可能调控肿瘤细胞的放射敏感度^[9]，但未做相关功能实验进行验证。

细胞周期调控是决定细胞放射敏感度的一个关键因素。辐射诱导DNA损伤，使细胞周期产生阻滞，如G₂/M期阻滞^[12]，为DNA修复提供充足的时间^[13]。本研究发现在细胞周期实验中，hep-2细胞转染UBE2N siRNA后，其S期显著延长，而G₂期显著缩短，增殖实验也表明沉默UBE2N增强hep-2细胞增殖，因此UBE2N调控细胞增殖和细胞周期可能是调节放射敏感度的重要机制。

细胞凋亡是影响细胞放射敏感度的重要原因，是一种潜在的放疗增敏机制^[14-15]，辐射可通过多种途径诱导细胞凋亡。本研究通过AnnexinV/PI双染法证实，经X线照射后，转染UBE2N siRNA较转染阴性对照NC的hep-2细胞凋亡比例明显减少。克隆形成率是反映细胞群体依赖性和增殖能力的重要指标。本研究发现经X线照射后，UBE2N沉默组细胞克隆形成率显著升高，提示沉默UBE2N能显著降低喉鳞癌细胞群体依赖性，并增强喉鳞癌细胞增殖能力。

综上所述，UBE2N通过调控细胞增殖、细胞周期进展、细胞克隆形成能力和细胞凋亡来影响喉鳞癌细胞放射抵抗。本研究在细胞水平探讨了UBE2N对人喉鳞癌细胞放射抵抗的影响，但相关动物实验和机制研究并未完成，因此，在体内外探讨UBE2N在人喉鳞癌细胞放射敏感度的机制是我们下一步需要完成的内容，以期为喉鳞癌放疗增敏提供新的可靠靶点。