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错配修复基因联合中性粒细胞/淋巴细胞比值预测结肠癌术后复发的价值

陈平, 林建光, 黄艳, 戴炀斌, 许天文

陈平, 林建光, 黄艳, 戴炀斌, 许天文. 错配修复基因联合中性粒细胞/淋巴细胞比值预测结肠癌术后复发的价值[J]. 肿瘤防治研究, 2021, 48(4): 370-374. DOI: 10.3971/j.issn.1000-8578.2021.20.0870
引用本文: 陈平, 林建光, 黄艳, 戴炀斌, 许天文. 错配修复基因联合中性粒细胞/淋巴细胞比值预测结肠癌术后复发的价值[J]. 肿瘤防治研究, 2021, 48(4): 370-374. DOI: 10.3971/j.issn.1000-8578.2021.20.0870
CHEN Ping, LIN Jianguang, HUANG Yan, DAI Yangbin, XU Tianwen. Value of Mismatch Repair Genes Combined with Neutrophil-Lymphocyte Ratio in Predicting Postoperative Recurrence of Colon Cancer[J]. Cancer Research on Prevention and Treatment, 2021, 48(4): 370-374. DOI: 10.3971/j.issn.1000-8578.2021.20.0870
Citation: CHEN Ping, LIN Jianguang, HUANG Yan, DAI Yangbin, XU Tianwen. Value of Mismatch Repair Genes Combined with Neutrophil-Lymphocyte Ratio in Predicting Postoperative Recurrence of Colon Cancer[J]. Cancer Research on Prevention and Treatment, 2021, 48(4): 370-374. DOI: 10.3971/j.issn.1000-8578.2021.20.0870

错配修复基因联合中性粒细胞/淋巴细胞比值预测结肠癌术后复发的价值

基金项目: 

泉州市科技项目 2018Z099

泉州市科技局高层次人才科研经费项目 2018C051R

详细信息
    作者简介:

    陈平(1994-),男,硕士在读,主要从事消化道肿瘤的研究

    通讯作者:

    许天文(1973-),男,博士,主任医师,主要从事消化道肿瘤、肿瘤姑息治疗与人文关怀相关的研究,E-mail: xutianwen53@163.com

  • 中图分类号: R735.3+5

Value of Mismatch Repair Genes Combined with Neutrophil-Lymphocyte Ratio in Predicting Postoperative Recurrence of Colon Cancer

Funding: 

Quanzhou Science and Technology Project 2018Z099

High-level Talent Scientific Research Funding of Quanzhou Science and Technology Project 2018C051R

More Information
  • 摘要:
    目的 

    探讨不同错配修复基因(MMR)状态结肠癌临床病理特征,进一步评估MMR联合术前血中性粒细胞/淋巴细胞比值(NLR)用于预测结肠癌术后复发的价值。

    方法 

    回顾性分析125例结肠癌根治术后MMR免疫组织化学结果,分为错配修复缺陷组(dMMR)(55例),错配修复基因正常组(pMMR)(70例),并按MMR状态和NLR高低分为四组。

    结果 

    相比pMMR组,dMMR组结肠癌患者发病年龄较低,肿瘤体积大,分化程度低,多发于右半结肠,更多见神经侵犯(P < 0.05);ROC曲线确定NLR界值为3,dMMR组中低NLR值比例明显高于pMMR组(P < 0.05);按MMR状态和NLR高低分为四组后,dMMR并低NLR组3年无复发生存率为85.0%,明显高于其他三组(P < 0.05);生存分析显示与pMMR并高NLR组比较,dMMR并低NLR组存在显著的术后生存优势。

    结论 

    dMMR结肠癌具有独特的临床病理特征,MMR状态联合NLR值可用于评估结肠癌患者术后复发风险。

     

    Abstract:
    Objective 

    To investigate the clinicopathological characteristics of colon cancer patients with different mismatch repair gene (MMR) status and evaluate the value of MMR status combined with preoperative blood neutrophil-lymphocyte ratio (NLR) in predicting postoperative recurrence of colon cancer.

    Methods 

    We retrospectively analyzed the pathological MMR immunohistochemistry results of 125 colon cancer patients after radical resection. Patients were divided into deficient mismatch repair (dMMR) group (n=55) and proficient mismatch repair (pMMR) group (n=70), and further divided into four groups according to MMR status and NLR level.

    Results 

    Compared with the pMMR group, the patients in the dMMR group had younger onset age, larger tumor size, lower differentiation and more nerve invasion, and were more likely to occur in the right hemicolon (P < 0.05). According to the ROC curve, the NLR threshold was determined as 3. The proportion of low NLR in dMMR group was significantly higher than that in pMMR group (P < 0.05). The 3-year recurrence-free survival rate of the dMMR with low NLR group was 85.0%, significantly higher than those of the other three groups (P < 0.05); Survival analysis showed a significant advantage of the dMMR with low NLR group comparing with the pMMR with high NLR group.

    Conclusion 

    dMMR colon cancer has unique clinicopathological characteristics. MMR status combined with NLR value can be used to evaluate the postoperative recurrence risk of colon cancer patients.

     

  • 目前,化学治疗仍是三阴性乳腺癌的主要治疗方法之一,但是肿瘤细胞对化疗药物的耐药性严重影响了治疗效果,化疗药物与肿瘤细胞的接触是诱导继发性耐药的主要原因[1]。由于阿霉素是乳腺癌化学方案的常用药物[2],本研究观察阿霉素对三阴性乳腺癌耐药性的诱导作用并探究其机制。

    ATP结合盒(ABC)转运蛋白在耐药的发展中起着至关重要的作用。ATP结合盒亚家族G成员2(ATP-binding cassette, sub-family G member 2, ABCG2)能排出大量异质化合物,导致耐药,引起治疗抵抗[3]。细胞耐药性的产生及耐药蛋白的表达受多种转录因子的调控。有研究报道cMyc能够调控包括ABCG2在内的ABC转运蛋白的表达[4]。cMyc是一个多功能的转录因子,参与调节细胞对阿霉素的敏感度[5],而cMyc的表达受其上游基因Stat3的调控。Stat3在肿瘤组织中异常激活,引发其下游靶基因cMyc转录,从而使正常细胞转化为癌细胞,并增加肿瘤细胞的耐药性[6]。因此,本研究观察阿霉素对MDA-MB-468细胞耐药性的诱导作用并探讨Stat3-cMyc通路是否介导了耐药性的发生。

    人乳腺癌MDA-MB-468细胞株购自美国标准细胞库(American type culture collections, ATCC)。本研究实验剂和仪器包括:RPMI 1640培养基(Hyclone,美国)、青霉素/链霉素(索莱宝,北京,中国)、胎牛血清(四季青,杭州,中国)、阿霉素(索莱宝,北京,中国)、RIPA裂解液/苯甲基磺酰氟(索莱宝,北京,中国)、聚偏二氟乙烯膜(Millipore,Billerica,美国)、ABCG2抗体(Abcam,Cambridge,美国)、WP1066抑制剂(Selleckchem,上海,中国)和二甲基亚砜(索莱宝,北京,中国)等。

    人乳腺癌MDA-MB-468细胞用含10%FBS和1%青霉素/链霉素的RPMI 1640在37℃、5%CO2培养箱中培养。以不同浓度的阿霉素(0、0.05、0.1和0.5 μmol/L)孵育细胞24 h,观察并筛选最适阿霉素浓度进行后续实验。

    细胞以3 000个/孔的密度接种至96孔板,然后分别加入终浓度为0、0.05、0.1和0.5 μmol/L的阿霉素。24 h后,每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)继续培养4 h,吸弃培养液,每孔加150 μl DMSO溶液,振荡15 min后测定570 nm处的吸光度(OD570)。

    将盖玻片置于24孔板孔底,分别将MDA-MB-468和MDA-MB-468/ADM细胞以1×104个/孔接种,待细胞爬满盖玻片后进行免疫荧光染色。用PBS轻轻冲洗后在4%多聚甲醛中固定15 min。PBS洗涤爬片3次,山羊血清封闭1 h。将细胞用ABCG2一抗在4℃冰箱中孵育、过夜。PBS洗涤后,用二抗于37℃温育1 h。PBS洗涤细胞,用DAPI染色10 min,再次洗涤3次后滴加荧光防淬灭剂,观察免疫荧光染色并拍照。

    抽提各组细胞的总蛋白,利用BCA法测定总蛋白浓度,以每个泳道20 μg浓度的蛋白样品上样,经SDS-PAGE电泳后,利用半干电转化法将蛋白转移至PVDF膜上,经过封闭、一抗(稀释倍数1:1 000)孵育、TBST洗脱、HRP标记的二抗(稀释倍数1:5 000)孵育、TBST再洗脱等步骤后,用增强化学发光法检测信号及X线片曝光,并且经定影显影处理,获得清晰条带。

    运用SPSS13.0统计软件进行分析,所有结果采用(x±s)表示,组间均数的比较采用独立t检验(双侧),P < 0.05为差异有统计学意义。

    不同浓度阿霉素作用于MDA-MB-468细胞24 h后可见0.05 μmol/L与0.1 μmol/L浓度的阿霉素未引起细胞明显的损伤,大部分细胞生长良好。当浓度增加到0.5 μmol/L时,几乎所有细胞都受损,可见大量坏死细胞;MTT法测得在0.05 μmol/L、0.1 μmol/L及0.5 μmol/L浓度下阿霉素对MDA-MB-468细胞的抑制率分别为0.14、0.20、0.38,而且阿霉素对MDA-MB-468细胞的半数最大效应浓度(concentration for 50% of maximal effect, EC50)为0.94 μmol/L(P=0.038)。综合以上结果,我们选用0.1 μmol/L的阿霉素继续进行后续研究。

    用0.1 μmol/L的阿霉素持续刺激MDA-MB-468细胞4周后获得耐药细胞,命名为MDA-MB-468/ADM。MTT实验检测MDA-MB-468/ADM细胞对阿霉素敏感度,结果显示MDA-MB-468/ADM的EC50为5.2 μmol/L,较MDA-MB-468的EC50(0.94 μmol/L)显著升高(P=0.041),说明长期使用0.1 μmol/L的阿霉素后,MDA-MB-468细胞对阿霉素的敏感度显著下降,产生耐药,见图 1

    图  1  MTT测定经24h处理后的MDA-MB-468细胞与MDA-MB-468/ADM细胞对阿霉素的敏感度(x±s, n=3)
    Figure  1  Sensitivity of MDA-MB-468 and MDA-MB-468/ADM cells to adriamycin after 24h treatment detected by MTT assay (x±s, n=3)

    与正常MDA-MB-468细胞相比,MDA-MB-468/ADM细胞中代表ABCG2表达水平的红色荧光明显增多增强,见图 2A。Western blot检测结果也表明了MDA-MB-468/ADM细胞中ABCG2的高表达,见图 2B。提示用0.1 μmol/L阿霉素持续刺激后,三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞对阿霉素产生耐药。

    图  2  MDA-MB-468/ADM细胞中耐药蛋白ABCG2的表达
    Figure  2  Expression of drug resistance protein ABCG2 in MDA-MB-468/ADM cells
    A: Immunofluorescence staining results showed the increased expression of ABCG2 (red) in MDA-MB-468/ADM cells, staining with DAPI (blue); B: Western blot analysis results showed high expression of ABCG2 in MDA-MB-468/ADM cells (n=3, *: P < 0.05)

    为探究MDA-MB-468细胞对阿霉素产生耐药的机制,我们进一步检测了MDA-MB-468/ADM细胞中转录因子p-stat3与cMyc的表达水平,观察MDA-MB-468细胞对阿霉素耐药性的产生是否与Stat3-cMyc途径有关。Western blot结果显示,MDA-MB-468/ADM中p-Stat3与cMyc的表达均明显升高,而两组细胞中总的Stat3表达水平未见显著变化。这些结果表明Stat3的激活和cMyc表达的增多可能参与了MDA-MB-468细胞对阿霉素耐药性的产生,见图 3

    图  3  Western blot检测在MDA-MB-468和MDA-MB-468/ADM细胞中p-Stat3、Stat3及cMyc的表达(n=3, *: P < 0.05, **: P < 0.01)
    Figure  3  p-Stat3, Stat3 and cMyc expression in MDA-MB-468 and MDA-MB-468/ADM cells analyzed by Western blot (n=3, *: P < 0.05, **: P < 0.01)

    为进一步证明Stat3-cMyc途径在阿霉素诱导三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞耐药性产生中的作用,我们用Stat3磷酸化的抑制剂WP1066抑制Stat3活化,观察转录因子cMyc的表达是否受到影响。结果显示WP1066(1.25 μmol/L)作用于MDA-MB-468/ADM细胞后,磷酸化的Stat3显著降低(P=0.014),同时cMyc表达水平明显下降(P=0.044)。另外WP1066处理后MDA-MB-468/ADM细胞耐药蛋白ABCG2的表达也显著减少(P=0.000)。这些结果进一步说明阿霉素通过Stat3-cMyc途径诱导了MDA-MB-468细胞耐药性的产生,而抑制Stat3的活化后,耐药蛋白表达减少,细胞的耐药性减弱,见图 4

    图  4  Western blot检测MDA-MB-468、MDA-MB-468/ADM、MDA-MB-468/ADM/WP1066三组细胞中p-Stat3、Stat3、cMyc及ABCG2的表达
    Figure  4  Stat3, p-Stat3, cMyc and ABCG2 expression in MDA-MB-468, MDA-MB-468/ADM and MDA-MB-468/ADM/WP1066 cells analyzed by Western blot
    *: P < 0.05, **: P < 0.01 (x±s, n=3)

    由于WP1066下调了耐药蛋白ABCG2的表达,因此我们进一步通过MTT法检测MDA-MB-468/ADM细胞对阿霉素敏感度的变化。结果显示,阿霉素对MDA-MB-468/ADM细胞的EC50为6.774 μmol/L,而在使用WP1066之后的EC50降低至1.29 μmol/L(P=0.000),这表明WP1066抑制Stat3的活化增强了MDA-MB-468/ADM细胞对阿霉素的敏感度,见图 5

    图  5  MTT法检测经36 h处理后的MDA-MB-468、MDA-MB-468/ADM、MDA-MB-468/ADM/WP 1066三组细胞对阿霉素的敏感度(x±s, n=3)
    Figure  5  Sensitivity of MDA-MB-468, MDA-MB-468/ADM and MDA-MB-468/ADM/WP1066 cells to adriamycin after 36h treatment detected by MTT assay (x±s, n=3)

    目前肿瘤细胞的耐药性是临床治疗的难点与研究的热点,阐明肿瘤耐药的机制可以为肿瘤的治疗提供新的治疗方向和靶点。

    本研究应用低剂量阿霉素持续诱导人三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞,导致细胞产生耐药性,对阿霉素的敏感度显著下降,耐药蛋白ABCG2表达增高。为探究MDA-MB-468细胞对阿霉素产生耐药的机制,本实验进一步检测了MDA-MB-468/ADM细胞中转录因子p-stat3与cMyc的表达水平,观察MDA-MB-468细胞对阿霉素耐药性的产生与Stat3-cMyc途径有关。为进一步证明Stat3-cMyc途径在阿霉素诱导三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞耐药性产生中的作用,实验用Stat3磷酸化的抑制剂WP1066抑制Stat3活化,发现转录因子cMyc的表达也受到影响。进一步的机制研究揭示了Stat3-cMyc通路在阿霉素诱导的耐药中具有重要作用。

    文献报道,Stat3信号通路与肿瘤细胞对化疗的耐药性有关[7]。Stat3的激活可以帮助癌细胞逃避由药物引起的死亡,从而诱发耐药性。Yue等[8]证明了Stat3的过度活化可以促进顺铂耐药的卵巢癌进展,相反,如果抑制Stat3信号通路则会促进耐药性癌细胞的凋亡,增加癌细胞对各种药物的敏感度。Li等[9]研究也有相似的发现,抑制Stat3信号通路后人胃癌细胞的凋亡增强,耐药性减弱。那么Stat3在三阴性乳腺癌耐药性的产生中有何作用?文献报道,乳腺癌组织中Stat3的活化增强与乳腺癌的临床分期和侵袭转移密切相关[10]。多种致癌性细胞因子与细胞膜的相应受体结合后导致Stat3与酪氨酸磷酸化通道相偶联后被激活,激活后的Stat3可在核内与特异性DNA启动子相结合,调节cMyc、Oct4、Sox2等相关基因表达[11]。作为调节多种转录因子功能的重要枢纽,Stat3有望成为肿瘤基因治疗中的有效靶点。有研究表明,在肿瘤中cMyc的表达水平与耐药性有关[4, 12-13],cMyc能够调控ABC转运蛋白的表达水平,而ABCG2与肿瘤细胞的耐药性直接相关,但Stat3/cMyc在三阴性乳腺癌产生耐药性方面的影响及机制却未见报道。

    本研究发现低浓度(0.1 μmol/L)阿霉素持续刺激使MDA-MB-468细胞对阿霉素的敏感度明显降低,MDA-MB-468/ADM细胞中p-Stat3和cMyc的表达较MDA-MB-468细胞显著增加,这些发现与上述文献中对Stat3和cMyc在肿瘤耐药性中的作用相一致。另外,刘丽等[6]在喉鳞癌细胞的研究中也揭示了Stat3-cMyc通路的重要作用,与本研究的结果相吻合。由此推测,MDA-MB-468/ADM对阿霉素耐药的机制很可能与Stat3的激活和p-Stat3介导的cMyc表达的增多有关。为进一步证明Stat3-cMyc通路在阿霉素诱导的乳腺癌耐药性中的关键作用,本实验应用WP1066抑制MDA-MB-468/ADM中Stat3的活化,发现随着p-Stat3的降低,cMyc和ABCG2的表达也相应下降,这与Granato等[14]证实抑制Stat3信号可下调cMyc的表达一致。再次MTT检测发现WP1066作用后MDA-MB-468/ADM细胞对阿霉素的敏感度显著增强,这与Li等[9]研究结果一致。

    总之,本实验结果表明阿霉素可以诱导Stat3活化,上调转录因子cMyc及耐药蛋白ABCG2的表达,促进了三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞对阿霉素耐药性的产生。因此,抑制Stat3的表达与活化可有效逆转乳腺癌对阿霉素的耐药性,特异性靶向Stat3-cMyc途径联合化疗药物治疗有望成为一种有效治疗乳腺癌的新措施,改善乳腺癌患者的预后。

    Competing interests: The authors declare that they have no competing interests.
    作者贡献
    陈平:选题设计,收集数据,文章撰写和修改
    林建光、戴炀斌:收集数据,协助文章撰写和修改
    黄艳:收集病例
    许天文:指导论文选题设计与修改
  • 图  1   结肠癌患者NLR值ROC曲线

    Figure  1   ROC curve of NLR value of colon cancer patients

    图  2   不同MMR状态和NLR水平组的生存分析曲线

    Figure  2   Survival curves of different MMR status and NLR level groups

    表  1   结肠癌患者临床资料(n(%))

    Table  1   Clinical data of colon cancer patients (n(%))

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    表  2   不同MMR状态和NLR水平组的3年无复发生存率情况比较(n(%))

    Table  2   Comparison of 3-year relapse-free survival rates among groups with different MMR status and NLR level (n(%))

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    表  3   不同MMR状态和NLR水平组的Log rank检验结果

    Table  3   Log rank statistics result of different MMR status and NLR level groups

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图(2)  /  表(3)
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-07-21
  • 修回日期:  2020-10-09
  • 网络出版日期:  2024-01-12
  • 刊出日期:  2021-04-24

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