0   引言

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我国以及东南亚地区常见的头颈部恶性肿瘤之一，死亡率约为1.74/100 000^[1]。鼻咽癌治疗后复发病例占治疗失败病例的30%，复发的鼻咽癌往往具有肿瘤乏氧^[2]、肿瘤侵袭能力增强、治疗前贫血^[3]等更加恶劣的病理学表现，从而加大复发后的治疗难度。研究表明，鼻咽癌复发患者5年内生存率仅为30%^[4]。乏氧诱导因子-1α(hypoxia induce factor-1α, HIF-1α)是机体应对乏氧的主要效应因子，已经被证实与肿瘤缺氧、侵袭能力增强等细胞生物学行为密切相关^[5]。程序死亡受体-配体1(programmed death ligand 1, PD-L1)是程序性死亡受体1(programmed death 1, PD-1)的配体之一，可以抑制T细胞的活化，诱导肿瘤患者体内T细胞凋亡从而导致肿瘤细胞免疫逃逸^[6]。临床研究表明在口腔癌和肺癌中PD-L1的表达与HIF-1α有关^[7-8]。因此，乏氧诱导的鼻咽癌恶化很可能与HIF-1α调节PD-L1的表达相关，但具体调控机制尚未明确。本实验以鼻咽癌细胞为研究对象，通过在乏氧条件下沉默HIF-1α基因，检测细胞增殖和细胞凋亡率，研究了乏氧条件下鼻咽癌中HIF-1α对于鼻咽癌细胞生物学行为的影响，并且初步探讨鼻咽癌细胞中HIF-1α通过上调PD-L1促进鼻咽癌恶性发展的相关分子机制。

1   材料与方法

1.1   细胞株

人类鼻咽癌细胞系CNE2(低分化癌)，由中山肿瘤防治中心赠予。

1.2   主要试剂

RPMI 1640培养基购自美国Hyclone公司，胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)、青霉素-链霉素双抗浓缩液(×100)、无血清培养基Opti-MEM、胰酶(Trypsin-EDTA)购自美国Gibco公司；核糖核酸酶抑制剂、MTT细胞增殖检测剂购自美国Sigma公司；Triton-X 100购自北京中杉金桥生物技术有限公司；HIF-1α小鼠单克隆抗体(93kD)、STAT3兔单克隆抗体(88kD)、PSTAT3兔单克隆抗体(88kD)、PD-L1兔单克隆抗体(40~45kD)、兔多抗GAPDH(37kD)均购自英国Abcam公司；RNA提取试剂TRIzol reagent、Lipofectamine^TM 2000购自美国Invitrogen公司；反转录试剂盒、PCR Master Mix试剂盒购自加拿大Fermentas公司；siRNA及PCR目标基因引物的合成由北京擎科新业生物技术有限公司提供。

1.3   细胞培养与转染

采用10%FBS、1%青霉素和链霉素的RPMI 1640培养基培养细胞。取对数生长期、生长状态良好的CNE2细胞，进行细胞计数，并以每孔2×10⁵个细胞接种于6孔板，37℃、5%CO₂培养箱中培养。设常氧组、乏氧组、HIF-1α-siRNA+乏氧组、NC-siRNA+乏氧组四组进行实验。常氧组的细胞在20%O₂中培养，乏氧组在1%O₂中培养，HIF-1α-siRNA+乏氧组的细胞在1%O₂中培养并转染HIF-1α-siRNA，NC-siRNA+乏氧组在1%O₂中培养并转染NC-siRNA。按照脂质体Lipofectamine^TM2000转染试剂说明书进行细胞转染，将根据HIF-1α序列设计筛选的HIF-1α-siRNA转染至CNE2细胞，同时另设一组CNE2细胞转染无意义的干扰序列NC-siRNA作为对照。培养48 h后进行后续实验，转染序列见表 1。

表  1  转染序列

Table  1  Transfection sequence

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1.4   RNA提取与PCR定量检测

按照不同的条件处理细胞以后，弃去培养基停止培养，加入TRIzol提取总RNA，按照反转录试剂盒说明书将RNA反转录成cDNA，PCR产物通过1.2%琼脂糖凝胶电泳分离，于凝胶成像仪中成像。同时按照荧光定量PCR试剂盒说明书检测mRNA水平。反应条件为：50℃ 2 min，95℃ 10 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，40个循环。引物序列见表 2。最终数据采用2^-ΔΔCt方法进行分析(检测siRNA敲低效率)。通过RT-PCR检测HIF-1α、PD-L1及STAT3分子的mRNA表达水平。

表  2  引物序列及扩增片段长度

Table  2  Primer sequence and amplified fragment length

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1.5   MTT测定细胞增殖率

将各组细胞按照不同条件处理后，弃去培养基终止培养后，用0.25%的胰酶消化，按照每孔5×10⁴个/毫升接种至96孔板，按照不同条件培养过夜后，每孔加入10 μl MTT，37℃孵育4 h后，加入150 μl DMSO，最后用酶标仪测量568 nm波长处的OD值，细胞存活率(%)=(实验组OD均值/对照组OD均值)×100%。

1.6   流式细胞术检测细胞凋亡率

将各组不同细胞按不同条件处理后，48 h收集各组细胞，按AnnexinV-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒说明书进行检测，加入Bind Buffer混匀，反应15 min后加入Annexin-APC检测试剂混匀，最后上流式细胞仪检测。

1.7   Western blot法检测蛋白表达

按照不同条件处理细胞各组细胞后，弃去培养基终止培养，每皿加入100 μl细胞裂解液(PMSF: 裂解液=1:100)裂解细胞，冰上裂解30 min后收集裂解的细胞，按照BSA试剂盒测量提取的蛋白浓度。将提取的蛋白用5×蛋白上样缓冲液混合后，在沸水中煮沸变性。样品用10%分离胶或者8%分离胶以及5%浓缩胶进行电泳分离，电转、封闭之后，4℃孵育一抗过夜(GADPH: 1:1 000，STAT3: 1:1 500, PSTAT3: 1:200 000, HIF-1α: 1:1 000, PD-L1: 1:1 000)，第二日用HRP标记羊抗兔二抗室温孵育2 h，最后用凝胶成像仪成像，BandScan5.0分析胶片灰度值。

1.8   统计学方法

数据应用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析。实验数据采用SPSS17.0软件进行分析；双侧检验P < 0.05为差异有统计学意义。

2   结果

2.1   乏氧条件下及沉默HIF-1α基因后CNE2细胞的增殖变化

我们针对HIF-1α设计合成了三条不同的siRNA序列，筛选出其中敲低效率最高的一条，即HIF-1α-siRNA-2进行后续实验，见图 1A。MTT实验结果显示乏氧条件下细胞增殖率显著大于常氧组(均P=0.000)，见图 1B。与常氧组相比，HIF-1α-siRNA+乏氧显著降低了细胞增殖率(P=0.000)；与NC-siRNA+乏氧组相比，HIF-1α-siRNA+乏氧也显著降低了细胞增殖(P=0.000)。由此可得，乏氧条件下HIF-1α在CNE2的细胞增殖中发挥了重要作用。

图  1  转染HIF-1α-siRNA后CNE2细胞对HIF-1α基因的沉默效率(A)和MTT检测不同处理条件下CNE2细胞的增殖水平(B)

Figure  1  Silencing efficiency of HIF-1α in CNE2 cells(A) and proliferation of CNE2 cells under different treatment conditions detected by MTT(B)

^***: P < 0.001.

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2.2   乏氧条件下及沉默HIF-1α基因后CNE2细胞的凋亡变化

流式细胞术显示，乏氧条件下细胞凋亡率与常氧培养条件下细胞凋亡率无明显差异。相比于乏氧组的细胞，乏氧条件下转染HIF-1α-siRNA后显著增加了细胞凋亡率(P=0.000)。此外，HIF-1α-siRNA+乏氧组的细胞凋亡率也明显大于NC-siRNA+乏氧组(P=0.001)，见图 2。实验结果提示靶向沉默HIF-1α基因能够促进人鼻咽癌细胞CNE2的凋亡。

图  2  流式细胞术检测不同处理条件下CNE2细胞的凋亡水平

Figure  2  Apoptosis of CNE2 cells under different treatment conditions detected by flow cytometry

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2.3   乏氧条件下及沉默HIF-1α基因后HIF-1α、PD-L1及STAT3 mRNA表达水平的变化

RT-PCR检测显示，乏氧组的HIF-1α mRNA水平显著高于常氧组(P=0.004)，HIF-1α-siRNA转染后CNE2细胞HIF-1α mRNA水平显著下降，显著低于乏氧组(P=0.000)和NC-siRNA+乏氧组(P=0.000)，显示转染成功，见图 3。HIF-1α-siRNA+乏氧组的PD-L1 mRNA水平显著低于乏氧组(P=0.000)和NC-siRNA+乏氧组(P=0.000)，显示HIF-1α mRNA水平与PD-L1 mRNA水平呈正比。此外，乏氧组的STAT3 mRNA表达水平相比常氧组显著上升(P=0.009)，HIF-1α-siRNA+乏氧组的STAT3 mRNA水平显著低于乏氧组(P=0.001)和NC-siRNA+乏氧组(P=0.001)，见图 4。结果表明HIF-1α mRNA水平与PD-L1 mRNA水平成正相关，且STAT3可能是HIF-1α正性调控PD-L1的关键信号因子。

图  3  RT-PCR检测CNE2细胞中HIF-1α、PD-L1及STAT3的表达

Figure  3  HIF-1α, PD-L1 and STAT3 expression in CNE2 cells detected by RT-PCR

1: Normoxia; 2: Hypoxia; 3: HIF-1α-siRNA+Hypoxia; 4: NC-siRNA+Hypoxia.

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图  4  不同条件下CNE2细胞中HIF-1α(A)、PD-L1(B)及STAT3(C)mRNA表达水平的变化

Figure  4  HIF-1α(A), PD-L1(B) and STAT3(C) mRNA expression in CNE2 cells under different conditions

^**: P < 0.01; ^***: P < 0.001; 1: Normoxia; 2: Hypoxia; 3: HIF-1α-siRNA+Hypoxia; 4: NC-siRNA+Hypoxia.

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2.4   乏氧条件下及沉默HIF-1α基因后HIF-1α、PD-L1、STAT3和pSTAT3蛋白的表达

Western blot检测结果显示，乏氧组的HIF-1α蛋白水平显著高于常氧组(P=0.004)，HIF-1α-siRNA转染后的CNE2细胞HIF-1α分子蛋白水平显著下降，显著低于乏氧组(P=0.001)和NC-siRNA+乏氧组(P=0.001)。同时，HIF-1α-siRNA+乏氧组的PD-L1蛋白水平显著低于乏氧组(P=0.017)和NC-siRNA+乏氧组(P=0.0017)，显示HIF-1α分子蛋白水平与PD-L1蛋白水平成正比。此外，相比常氧组，乏氧组的STAT3和pSTAT3蛋白表达水平均显著上升(P=0.011)，HIF-1α-siRNA+乏氧组的STAT3蛋白水平显著低于乏氧组(P=0.009)和NC-siRNA+乏氧组(P=0.001)，HIF-1α-siRNA+乏氧组的pSTAT3蛋白水平显著低于乏氧组和NC-siRNA+乏氧组(均P < 0.001)，见图 5~6。实验结果表明，乏氧条件下，随着HIF-1α诱导PD-L1的高表达，STAT3磷酸化水平也增加。反之，HIF-1α的靶向沉默抑制了PD-L1的表达和STAT3磷酸化水平。我们认为HIF-1α诱导PD-L1表达上调可能通过活化STAT3实现。

图  5  Western blot检测CNE2细胞中HIF-1α, PD-L1, STAT3及pSTAT3蛋白的表达

Figure  5  HIF-1α, PD-L1, STAT3 and pSTAT3 protein expression in CNE2 cells detected by Western blot

1: Normoxia; 2: Hypoxia; 3: HIF-1α-siRNA+Hypoxia; 4: NC-siRNA+Hypoxia.

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图  6  不同条件下CNE2细胞中HIF-1α(A)、PD-L1(B)、STAT3(C)及pSTAT3(D)蛋白表达水平的变化

Figure  6  HIF-1α(A), PD-L1(B), STAT3(C) and pSTAT3(D) proteins expression in CNE2 cells under different conditions

^*: P < 0.05; ^**: P < 0.01; ^***: P < 0.001; 1: Normoxia; 2: Hypoxia; 3: HIF-1α-siRNA+Hypoxia; 4: NC-siRNA+Hypoxia.

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3   讨论

鼻咽癌是我国最常见的头颈部恶性肿瘤之一，传统的治疗方法难以根治。乏氧在肿瘤微环境中非常常见，且能影响恶性肿瘤的生理状况。HIF-1α是乏氧环境下调控基因的重要转录因子^[8]。研究表明，HIF-1α在包括乳腺癌^[9]、鼻咽癌及结肠癌等多种人类肿瘤中过度表达，且HIF-1α高表达往往与恶性肿瘤患者的不良预后有关。有研究证明原花青素可以通过降低HIF-1α从而抑制鼻咽癌细胞生长^[10]。然而，HIF-1α在鼻咽癌中的具体机制尚不明确。本研究发现，乏氧组HIF-1α高表达下的高增殖率和低凋亡率可被siRNA-HIF-1α转染有效逆转。这些结果证明HIF-1α表达可以促使乏氧条件下鼻咽癌的恶性进展。

随着免疫治疗的发展，PD-L1的表达水平与鼻咽癌发展开始得到密切关注。PD-L1往往在肿瘤细胞表面高表达，通过与PD-1的结合抑制T细胞活化，促进肿瘤细胞免疫逃逸。研究表明乏氧条件下HIF-1α可能通过调节PD-L1，造成肿瘤细胞免疫耐受，促进癌症恶性发展^[11-14]。最新研究发现鼻咽癌白人患者中肿瘤细胞上PD-L1表达与不良结果相关^[15]。本研究发现，鼻咽癌细胞中HIF-1α的表达与PD-L1的表达呈显著正相关。除此之外，乏氧条件下，鼻咽癌细胞中STAT3 mRNA和蛋白水平显著高于常氧组，而转染siRNA-HIF-1α逆转了这一现象，同时降低了STAT3的磷酸化水平。已有研究报道STAT3是介导PD-L1表达的调控因子^[16]，而伊卡利汀可以通过抑制STAT3磷酸化抑制鼻咽癌细胞CNE2的增殖、迁移和侵袭^[17]。因此，PD-L1可能是乏氧诱导鼻咽癌恶性进展的重要原因，并且涉及STAT3的活化，这与Xing等^[18]研究结论一致。

PD-L1免疫治疗可能给鼻咽癌治疗带来新的治疗策略。PD-L1抗体阿特珠单抗，Durvalumab已可以用来治疗非小细胞肺癌和膀胱癌^[19]。PD1免疫抑制剂联合化学疗法作为转移性鼻咽癌的一线治疗可以缓解91%患者的病情，34%复发鼻咽癌患者的病情^[20]，IFNβ和抗PD-1的组合可以增强NK细胞对鼻咽癌细胞的细胞毒性^[21]，但是尚未有临床报导PD-L1抑制剂对鼻咽癌的治疗作用。

PD-L1是鼻咽癌患者预后的独立影响因素^[22]，结合本研究发现，PD-L1在免疫耐受中的调控作用将会给鼻咽癌治疗带来新的方向，PD-L1有望为鼻咽癌免疫疗法提供新的分子靶标。另外，本研究在评估PD-L1的表达与临床鼻咽癌患者的相关性，验证PD-L1抑制剂对鼻咽癌的治疗作用等实验方面还待展开，如何使鼻咽癌免疫治疗更优化，需要我们结合更多的实验和大数据分析，进一步探索PD-L1影响鼻咽癌的相关机制，考察以PD-L1为靶点的治疗方案。