0   引言

原发性纵隔大B细胞淋巴瘤（primary mediastinal B-cell lymphoma, PMBL）是一种侵袭性B细胞淋巴瘤，占非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma, NHL）的2%~3%，多见于30~40岁女性^[1]。尽管采用了免疫治疗方案，10%~30%的PMBL患者仍有复发。难治性（relapsed/refractory, RR）疾病需要挽救治疗，且效果并不令人满意^[2]。PMBL利用PD-1/PD-L轴抑制抗肿瘤反应^[3]，抗CD30单抗（brentuximab vedotin, BV）在CD30阳性PMBL患者中表现出较好的疗效^[4]。文献报道60%~85%的PMBL表达CD23，而在非纵隔DLBCL和结外DLBCL中表达率较低^[5]。GATA3是鉴别PMBL和纵隔经典霍奇金淋巴瘤（classic Hodgkin’s lymphoma, CHL）的最有帮助的标志物^[6]，BCL-2在静息B细胞和T细胞上表达而在正常生发中心细胞上不表达，相反BCL-6在生发中心内的B和CD4⁺T细胞中表达，MUM1/IRF4和CD138反映了生发中心内B细胞成熟为浆细胞的最后步骤，但有关PMBL中的BCL-6和MUM1表达情况的研究还较少。与其他淋巴瘤不同，PMBL缺乏预后生物标志物，并且当非纵隔原发的非特指型弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma, not otherwise specified, DLBCL-NOS）累及纵隔时，临床上很难与原发性纵隔大B细胞淋巴瘤进行区分，因此我们选取了非纵隔DLBCL-NOS作为对照组，运用免疫组织化学法对诊断为PMBL、DLBCL-NOS组织中的治疗相关标志物PD-L1、PD-L2、CD30及CD23、BCL-2、BCL-6、MUM1、GATA3的表达进行检测及分析，探讨上述8种蛋白在PMBL诊断和预后评估中的应用价值，寻求更具特异性的免疫组织化学指标，提高对该病的诊断，以期为判断PMBL预后提供理论参考进而指导临床个体化治疗。

1   资料与方法

1.1   临床资料

选取2000—2019年中国医学科学院肿瘤医院病理科确诊的34例PMBL，对照组为随机抽取的同期31例非纵隔原发的DLBCL-NOS，取材涵盖了常见发病部位。34例PMBL患者有完整的随访资料，所有切片均由两位有经验的临床病理医师独立阅片，病理诊断依据WHO标准（2017版），结合临床特点、组织学形态、免疫表型及分子诊断，均已明确诊断。本研究所有患者均知情同意。

1.2   病理形态学观察及分级

1.2.1   制备组织切片

34例PMBL和31例DLBCL-NOS的肿瘤组织用4%的中性甲醛固定4~6 h，取1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm的组织块，5~10倍固定液中固定3~24 h，脱水、过夜（水洗、脱水、透明、浸蜡），石蜡包埋，切片厚度为3~5 μm，烘烤。

1.2.2   免疫组织化学染色

采用4 μm厚FFPE组织切片进行免疫组织化学染色，免疫组织化学采用EnVision法。切片经过脱蜡、水化、抗原修复后滴加一抗，主要一抗为PD-L1、PD-L2、CD30、CD23、GATA3、BCL-2、BCL-6和MUM1，一抗来源及阳性表达部位见表 1。按厂家说明书操作，温浴30~60 min后滴加二抗，DAB显色，苏木精对比染色，常规脱水、透明、封片。染色时每批均包括阴性对照和阳性对照。

表  1  免疫组织化学检测一抗来源及其染色部位

Table  1  Source and staining site of immunohistochemical antibody

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1.2.3   结果判读

PD-L1和PD-L2细胞膜染色肿瘤细胞的百分比，见表 2。针对抗体CD23、CD30和GATA3，选取代表区域计数10个高倍视野下阳性肿瘤细胞占细胞总数的百分比， < 10%阳性细胞判为阴性（-），阳性细胞数≥10%且染色弱阳性为（+），阳性细胞数≥10%且染色中等阳性为（++），阳性细胞数≥10%且染色强阳性为（+++），按照（+）（-）进行记录并分析。抗体BCL-2、BCL-6和MUM1的截断值为30%^[7]，结果记录见表 3。本研究中染色细胞百分率主要由两位有经验的临床病理专家评分，平均阳性细胞百分率用于分析，有争议的病例由第三位临床病理专家确认。标志物的诊断指标计算公式：敏感度=真阳性/（真阳性+假阴性），特异性=真阴性/（真阴性+假阳性），阳性预测值=真阳性/所有阳性，阴性预测值=真阴性/所有阴性。

表  2  PD-L1、PD-L2和CD30蛋白在PMBL和DLBCL-NOS中的阳性肿瘤细胞百分比[M (P25, P75), %]

Table  2  Percentage of positive tumor cells with PD-L1, PD-L2 and CD30 expression in PMBL and DLBCL-NOS [M (P25, P75), %]

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表  3  CD23、CD30、GATA3、BCL-2、BCL-6和MUM1蛋白在PMBL和DLBCL-NOS中的表达

Table  3  Expression of CD23, CD30, GATA3, BCL-2, BCL-6 and MUM1 proteins in PMBL and DLBCL-NOS groups

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1.3   随访

通过常规的复诊或电话对患者进行回顾性随访。主要研究终点是总生存期（overall survival, OS），其定义为从最初确诊到死亡或最后一次随访的时间（2020年11月）。记录以下随访内容：病程、治疗和预后情况、随访结束时的状况（死亡、存活或失访）、死亡原因和存活时间。

1.4   统计学方法

所有数据采用统计学软件SPSS20.0进行统计分析，检验水准α=0.05，P < 0.05为差异有统计学意义。各蛋白表达与PMBL和DLBCL-NOS患者临床及病理因素的关系采用卡方检验；PD-L1、PD-L2和CD30在PMBL和DLBCL-NOS中的阳性肿瘤细胞百分比组间比较采用非参数秩和检验；Kaplan-Meier法进行单变量生存分析并绘制生存曲线，Log rank检验比较生存差异。所有指标采用GraphPad Prism 8及SPSS20.0进行作图。

2   结果

2.1   临床特点

PMBL患者34例，其中男性19例（55.88%），女性15例（44.12%），中位年龄28岁（15~47岁）。随机选择非纵隔原发的DLBCL-NOS患者31例作为对照组，其中男20例（64.52%），女性11例（35.48%），中位年龄63岁（年龄17~84岁）。两组年龄分布差异有统计学意义（P < 0.01）。在PMBL组中，由纵隔压迫引起的症状是最主要的症状，全部34例病例均有大小不等的纵隔肿块。

2.2   PMBL病理特征

形态上PMBL肿瘤细胞弥漫分布，被纤细或粗大致密胶原分割，呈簇状、巢团状或结节状排列。肿瘤细胞中等大或稍大，胞质淡染，细胞核较圆或卵圆形，部分病例中可见Reed-Sternberg样细胞，见图 1A、B。PMBL组织形态上与累及纵隔的DLBCL-NOS有重叠，见图 1C、D，鉴别诊断需要免疫组织化学标志物的辅助。PMBL组中进行Ki-67标记，阳性细胞比例为30%~80%，其中64.71%（22/34）的病例表达超过60%，DLBCL-NOS组表达相似。

图  1  PMBL(A, B)与DLBCL-NOS(C, D)的HE染色(A, C: ×200; B, D: ×400)

Figure  1  HE staining of PMBL(A, B) and DLBCL-NOS (C, D) (A, C: ×200; B, D: ×400)

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2.3   PMBL与DLBCL-NOS的免疫表型

PMBL组和非纵隔原发的DLBCL-NOS组中PD-L1、PD-L2、CD30、CD23、BCL-2、BCL-6、MUM1和GATA3的表达见图 2。PD-L1、PD-L2和CD30在PMBL组阳性肿瘤细胞百分比的中位数分别为70%（30%, 90%）、25%（0, 70%）和17.5%（0, 60%），显著高于DLBCL-NOS组，差异有统计学意义（均P < 0.05），见表 2。PMBL组CD30阳性表达率为61.76%（21/34），DLBCL-NOS组为12.90%（4/31），差异有统计学意义（P=0.000）。与DLBCL-NOS组比较，CD30诊断PMBL的特异性为76.47%（13/17），阳性预测值为84%（21/25），阴性预测值为32.50%（13/40）。PMBL组CD23阳性率为76.47%（26/34），在DLBCL-NOS组中阳性表达率为9.68%（3/31），差异有统计学意义（P=0.000）。与DLBCL-NOS组比较，CD23诊断PMBL的特异性为72.73%（8/11），阳性预测值为89.66%（26/29），阴性预测值为22.22%（8/36）。GATA3（P=0.414）、BCL-2（P=0.480）、BCL-6（P=0.659）和MUM1（P=0.601）的表达在PMBL和DLBCL-NOS组之间差异均无统计学意义，见表 3。

图  2  CD23(A)、CD30(B)、GATA3(C)、BCL-2(D)、BCL-6(E)、MUM1(F)、PD-L1(G)和PD-L2(H)在PMBL中的阳性表达(×200)

Figure  2  Positive expression of CD23(A), CD30(B), GATA3(C), BCL-2(D), BCL-6(E), MUM1(F), PD-L1(G) and PD-L2(H) in PMBL group (×200)

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2.4   PMBL的随访与治疗

PMBL组有完整随访资料的患者28例，失访6例，随访率82.4%。死亡6例（6/28，21.43%），中位生存期为30.5月（4.2~166.1月），总体生存曲线见图 3。5例（5/28，17.86%）单纯采用CHOP方案化疗，16例（16/28，57.14%）常规化疗结合利妥昔单抗，1例（1/28，3.57%）PD-1抑制剂联合常规化疗4周期后达到完全缓解（complete response, CR），13例（13/28，46.43%）接受过放射治疗。伴有CD30或BCL-6表达的PMBL患者其生存曲线尽管P > 0.05，但仍显示出预后差的趋势，见图 4。

图  3  原发性纵隔大B细胞淋巴瘤患者总体生存曲线

Figure  3  Overall survival curve of patients with primary mediastinal large B-cell lymphoma

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图  4  伴有CD30(A)或BCL-6(B)表达的PMBL患者的生存曲线

Figure  4  Survival curves of PMBL patients with CD30(A) or BCL-6(B) expression

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3   讨论

原发性纵隔大B细胞淋巴瘤起源于胸腺髓质B细胞，是一种发病率较低但并不罕见的淋巴造血系统疾病，男女比约为1:3。本研究结果显示PMBL发病高峰年龄段为28岁左右，男女性别无差异，与既往文献女性患者居多的特点有所不同，而DLBCL-NOS患者多集中于老年人。组织学上，PMBL的肿瘤细胞多呈透明细胞或R-S（Reed-Sternberg）样细胞形态，且穿刺活检标本易挤压、固定不佳，致使难以识别而漏诊误诊，免疫组织化学可以协助诊断。PMBL表达B细胞抗原（如CD20，CD79α）和B细胞转录因子（如PAX-5、BOB.1、Oct-2等），不表达表面免疫球蛋白（Ig）和κ、λ^[8]。PMBL在形态学和细胞学上不同病例间具有较大的变异，CD30阳性率约为80%，个体差异较大且通常染色强度较弱，CD23阳性率约为70%，BCL-2阳性率约为55%~80%，BCL-6阳性率约为45%~100%^[9]。免疫组织化学研究对于PMBL和DLBCL-NOS的鉴别诊断必不可少，在本研究中我们探讨了治疗相关标志物PD-L1、PD-L2、CD30及CD23、BCL-2、BCL-6、MUM1和GATA3在PMBL诊断和预后评估中的应用价值，以期为判断PMBL预后提供理论参考进而指导临床的个体化治疗。

PD-L1和PD-L2经常由于特定的遗传突变而过度表达。PD-L1的表达具有时空异质性，PD-L1阴性肿瘤复发时可能变成PD-L1阳性肿瘤（反之亦然）。Ventana的sp263 PD-L1用于免疫组织化学检测时，建议病理学家的报告结果包括阳性肿瘤细胞百分比。对于PD-L2蛋白到目前为止还没有得到广泛的研究。9p24.1染色体异常多见于PMBL，相比之下这种异常在DLBCL中很少见^[10-12]。一些研究已经表明，PD-L1位点的畸变是PMBL的一个特征，并且PD-L1的表达与9p24.1的扩增相关^[13]。我们在PMBL中的研究结果表明，PD-L1和PD-L2在PMBL组的表达水平较高，与DLBCL-NOS组间差异有统计学意义（P < 0.05），因此PD-L1和PD-L2免疫组织化学检测可作为鉴别PMBL和DLBCL-NOS的辅助实验手段，有助于识别更多对免疫检查点抑制剂有反应的患者，但尚需进一步的前瞻性测试和验证，以确定免疫检查点抑制剂在淋巴瘤亚型中的疗效。基于KEYNOTE-170研究，帕博利珠单抗获得美国食品药品监督管理局（food and drug administration, FDA）复发/难治性（R/R）PMBL适应证批准。KEYNOTE-170研究中，应用帕博利珠单抗治疗R/R PMBL，中位随访43.1月后，76%的患者治疗反应持续时间（duration of response, DOR）超过36月，36月无进展生存（progress free survival, PFS）率达34.2%。因此，帕博利珠单抗单药治疗R/R PMBL显示出持久的抗肿瘤效应且安全可控^[3]。另外纳武利尤单抗联合CD30单抗治疗R/R PMBL的Ⅱ期临床研究也显示出纳武利尤单抗与维布妥昔单抗BV（brentuximab vedotin）的协同效应，其可作为桥接治疗方案^[4]。这些发现强调了PD-1/PD-L1轴在调节抗肿瘤免疫方面的重要性，以及在临床实践中靶向这一信号通路的好处。

CD30在临床中是一个非常重要的指标，除了淋巴造血系统肿瘤，CD30在非淋巴造血系统肿瘤中也可以表达。CD30能够帮助鉴别多种淋巴肿瘤，如霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’s lymphoma, HL）、间变大细胞淋巴瘤（anaplastic cell lymphoma, ALCL）^[14]。除此之外，CD30在一些T细胞淋巴瘤和B细胞淋巴瘤中都可以表达，但CD30的专一性、特异性不强，给淋巴瘤的病理诊断带来困难，需要结合形态以及其他免疫组织化学标记进行诊断。PMBL肿瘤细胞存在CD30高表达，本组试验结果亦显示CD30表达在PMBL与DLBCL-NOS组之间差异有统计学意义（P < 0.01），因此治疗相关标志物PD-L1、PD-L2和CD30均有助于区分PMBL与DLBCL-NOS。BV是一类CD30抗体偶联药物，可通过抑制微管蛋白合成和细胞分裂，诱导CD30阳性肿瘤细胞凋亡。BV联合纳武利尤单抗治疗R/R PMBL显现出良好的协同抗肿瘤活性，客观缓解率（objective response rate, ORR）达73%，完全缓解（complete response, CR）率为37%^[4]。CD23是一种低亲和力的IgE受体，还可作为成熟滤泡B细胞、活化巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和滤泡树突状细胞上的淋巴细胞生长因子。CD23在PMBL中的表达率为70%~85%^{[5, 15]}，与本研究在PMBL中观察到的76.47%相符。本研究表明CD23阳性有助于PMBL与DLBCL-NOS的鉴别诊断，与既往的结果^[16]一致。PMBL的分子遗传学特征中BCL-2和BCL-6基因重排少见，而有研究表明BCL-2表达是DLBCL的预后标志物^[17]。MUM1/IRF4是干扰素和细胞因子介导基因表达的重要调节剂，在既往的研究中，MUM1与DLBCL的不良预后相关^[18]，但本研究结果显示MUM1表达对PMBL的总体生存无影响，可能与本研究队列较小有关。CD30和BCL-6的预后价值值得下一步在更大的患者队列中进行验证。

综上所述，PMBL是一种起源于胸腺的成熟的侵袭性大B细胞淋巴瘤，具有独特的临床、免疫表型、基因型和分子特征。PMBL中治疗相关标志物PD-L1、PD-L2和CD30的表达水平较高，有助于识别更多可能对免疫或靶向治疗有反应的患者。免疫组织化学标记PD-L1、PD-L2、CD30和CD23有助于PMBL与DLBCL-NOS鉴别诊断，CD30和BCL-6在PMBL的预后方面显示了一定的趋势，但要作为PMBL的候选预后指标应该在更大量的样本中进一步研究。