0   引言

双表达大B细胞淋巴瘤(double-expression large B-cell lymphoma, DEL)临床上以MYC/BCL2双表达最为常见, 占弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)的19%~34%^[1-2], 已有较多研究证实DEL患者临床预后和治疗效果相对较差, 且易发展为复发/难治性大B细胞淋巴瘤^[3-6]。染色体9p24.2上CD274基因编码的PD-L1是程序性细胞死亡蛋白-1(programmed cell death 1, PD-1)的配体, 其相互结合可以介导肿瘤细胞获得免疫逃逸能力^[7-8]。研究^[9]发现MYC可以结合PD-L1的启动子, 促进其表达, 从而促进肿瘤的发生发展; 具有协同作用的原癌基因MYC、BCL2可能是影响PD-L1蛋白表达的上游基因, 三者在淋巴瘤的发病机制中发挥了重要作用^[9-11]。本研究收集了一组大B细胞淋巴瘤病例, 通过qPCR技术、免疫组织化学双标记和普通免疫组织化学染色法、临床病理资料收集和随访, 分析PD-L1表达与DEL的关系及其与患者预后的关系, 并探讨PD-L1表达在DEL临床预后评估中的价值。

1   资料与方法

1.1   病例收集

收集贵州医科大学附属医院病理科2010年1月1日至2017年12月31日期间确诊的DLBCL病例, 将临床病理资料相对完整、肿瘤组织充足的90例病例纳入实验研究。

1.2   主要试剂

PD-L1单抗购于美国Abcam公司, 单克隆一抗Pax5、MYC、BCL2和二抗试剂盒(PV-9001、SAP-9102)、EDTA修复液、AP-Red及DAB试剂盒均购自北京中杉公司; RNA提取试剂盒(FFPE RNA)购自厦门艾德公司; SYBR Green荧光染料(TaKaRa RR820A)、反转录试剂盒(TaKaRa RR47A)、内参均购于美国TaKaRa公司; PD-L1引物购于上海生工公司。

1.3   免疫组织化学染色及分组

采用PV二步法检测MYC、BCL2蛋白表达:MYC、BCL2以扁桃体组织为阳性对照; 以PBS(pH7.35)代替一抗作阴性对照; 以pH(8.0)的EDTA溶液修复抗原; MYC、BCL2稀释比均为1:200;步骤按PV-9001说明进行。

判读标准:MYC阳性信号位于细胞核, BCL2阳性信号位于细胞质。根据文献^[12-14]略作修改, 随机选择10个不重复的400倍视野, 每个视野随机计数400个肿瘤细胞中阳性细胞所占比例, 取10个视野的平均值作为该病例表达率。据文献^{[1-4, 12-14]}定义MYC ≥ 40%为高表达, BCL2 ≥ 70%为高表达。若MYC、BCL2均高表达定义为MYC/BCL2双表达大B细胞淋巴瘤组(简称DEL组), 余下归为non-DEL组。

1.4   免疫组织化学双标记染色检测PD-L1表达

根据试剂盒说明Pax5、PD-L1设置阳性对照为扁桃体组织, 阴性对照以TBS(pH7.35)替代一抗, 并以TBS作为缓冲液及冲洗液; 用间接法进行双标记染色, 染色步骤简述如下:4 μm厚石蜡切片, 脱蜡、水洗、EDTA(pH9.0)进行修复抗原, 消除内源性过氧化物酶后血清封闭, 先进行Pax5鼠抗人单克隆抗体染色(1:300稀释), 按(SAP-9102)试剂盒说明进行Pax5标记(AP-Red显色), 再次EDTA(pH8.0)修复后, 按Pax5染色的相同步骤进行PD-L1兔抗人单克隆抗体(1:250稀释)标记, DAB显色, 透明封片后进行观察和图像分析。

判读方法:Pax5以细胞核出现红色或浅红色颗粒为阳性表达; PD-L1以细胞质或细胞膜形成黄色或棕黄色颗粒为阳性表达。参照文献^[15-16]分析:同MYC、BCL2一样统计肿瘤细胞PD-L1表达率(10个高倍视野平均值), 定义肿瘤细胞双标记阳性细胞≥ 30%(细胞质或膜着黄色、核着红色)为肿瘤细胞PD-L1阳性(PD-L1⁺); 在PD-L1阴性的病例中, 若肿瘤微环境细胞(主要为肿瘤组织浸润T细胞tumor-infiltrating lymphocytes, TILs)PD-L1表达率≥ 20%, 定义为微环境PD-L1阳性^[15], 即mPD-L1⁺。

1.5   RNA提取、反转录、qPCR方法

RNA的提取、检测及反转录:取8 μm组织进行脱蜡、去除二甲苯、蛋白酶消化至清亮后, 按RNA提取试剂盒说明进行RNA提取, 最后以50 μl的DEPC水溶解RNA, 核酸定量仪检测RNA浓度及纯度, 取OD值(A260/A280)在1.8到2.0的RNA样本进行实验, 按TaKaRa RR47A试剂说明于冰上进行去除基因组DNA(42℃ 2 min), 于冰上配置反转录体系后进行反转录(37℃ 30 min, 再加热至85℃ 5 s), 缓慢冷却后于-80℃冰箱保存。

qPCR:使用两步法检测DEL组与non-DEL组PD-L1的mRNA, 据TaKaRa RR820A试剂盒说明, 取cDNA样本于冰上配置SYBR Green RT-qPCR反应体系, PD-L1引物:上游:5'-CTATGGTGGTGCCGACTACA-3', 下游:5'-TGCTTGTCCAGATGACTTCG-3', 每个样本设置3个复孔, 先配置总反应体系, 再分装3个复孔; 用β-actin(上游:5'-TAGTTGCGTTACA CCCTTTCTTG-3', 下游:5'-TCACCCTTCACCGTTCCAAGTTT-3')作为内参, 于Bio-Rad CFX connect荧光定量PCR仪上进行反应(反应条件:预变性95℃ 30 s, 变性95℃ 5 s, 退火/延伸为60℃ 30 s, 50个循环), 以2^-ΔΔCt值为mRNA相对表达量, ΔCt=Ct_目的基因-Ct_内参基因, ΔΔCt=ΔCt_样本-ΔCt_{组内最低值}。

1.6   随访方法

采取电话或走访方式, 以首次确诊时间为开始时间, 随访患者首次确诊以后的治疗、健康、复发及生存等情况; 每隔3月随访1次(出现死亡或失访时结束该例患者随访), 长期存活患者随访截至2018年12月31日。

1.7   统计学方法

用SPSS 17.0软件对数据整理分析; mRNA相对表达量在各组间比较采用t检验, 正态分布用()表示, 偏态分布数据经(lg10)转化为正态分布, 并用()表示。计数资料统计采用χ²检验或Fisher精确检验; 生存分析采用Kaplan-Meier曲线表示。P < 0.05为差异有统计学意义。

2   结果

2.1   一般资料

DLBCL90例, HE染色见图 1。男47例, 女43例; 年龄17~82岁(中位年龄58.5);根据免疫组织化学染色结果分组, 28例为DEL, 62例为non-DEL, 见图 2。据1993年NHL国际预后指数IPI评分:0~2分49例, 3~5分41例; 临床分期:Ⅰ+Ⅱ期54例, Ⅲ+Ⅳ期36例。

图  1  DLBCL的HE染色结果(HE ×400)

Figure  1  Hematoxylin-eosin staining results of diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) patients (HE ×400)

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图  2  DLBCL免疫组织化学染色结果(PV ×400)

Figure  2  Immunohistochemical results of DLBCL (PV ×400)

A: high myelocytomatosis oncogene(MYC) expression; B: high B-cell lymphoma-2(BCL2) expression; C: low MYC expression; D: low BCL2 expression.

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2.2   DEL组与non-DEL组PD-L1蛋白表达情况比较

90例DLBCL肿瘤细胞和微环境中PD-L1阳性分别为22例(24.44%)和26例(28.89%), 见图 3。DEL组肿瘤细胞和微环境中PD-L1阳性表达率分别为50.00%和32.14%, non-DEL组分别为12.90%和27.42%。肿瘤细胞和微环境PD-L1蛋白表达在DEL组与non-DEL组间比较, 差异均有统计学意义(均P < 0.05), 见表 1。

图  3  DLBCL中肿瘤细胞和微环境细胞PD-L1的表达(PV ×400)

Figure  3  PD-L1 expression in tumor cells and microenvironment cells of DLBCL (PV ×400)

PD-L1⁺ in tumor cells(A) and in microenvironment cells(B), while PD-L1^- in tumor cells and in microenvironment cells(C); PD-L1: programmed cell death ligand 1.

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表  1  DEL组与non-DEL组PD-L1蛋白表达的比较

Table  1  Comparison of PD-L1 protein expression between DEL and non-DEL groups

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2.3   DEL组与non-DEL组间PD-L1 mRNA相对表达量比较

qPCR检测结果显示DEL组(0.9862±0.49853)与non-DEL组(0.7175±0.29265)PD-L1 mRNA相对表达量比较, 差异有统计学意义(95% CI:0.06325~0.47419, t=2.653, P=0.012)。

2.4   DEL组中PD-L1表达与临床病理特征的关系

DEL组中, 25例检查血清乳酸脱氢酶(LDH)其中13例PD-L1⁺, 8例mPD-L1⁺, 4例mPD-L1^-; 24例检查β₂微球蛋白(β₂-MG), 其中14例PD-L1⁺, 7例mPD-L1⁺, 3例mPD-L1^-, IPI评分0~2分组、3~5分组均为14例, Ⅰ+Ⅱ期、Ⅲ+Ⅳ期分别为15例、13例; PD-L1⁺与性别、年龄、Ann Arbor分期、LDH、β₂-MG无相关性, 但与IPI评分和B症状的出现显著相关(P值分别为0.007、0.021);mPD-L1⁺与上述临床病理特征均无相关性(均P>0.05), 见表 2。

表  2  DEL组肿瘤细胞和微环境中PD-L1表达与临床病理特征的关系

Table  2  Relation between PD-L1⁺, mPD-L1⁺ and clinicopathological characteristics of DEL patients

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2.5   DEL患者预后及PD-L1蛋白表达生存分析

DEL组中, 生存8例, 死亡14例, 失访6例, 其中复发9例; 中位生存时间29月。20例接受R-CHOP治疗, 其余不详; Kaplan-Meier生存分析显示PD-L1⁺组患者总体生存时间(OS)明显短于PD-L1^-组(P=0.005), 见图 4; mPD-L1⁺组患者OS明显短于mPD-L1^-组(P=0.001), 见图 5。

图  4  DEL组中PD-L1⁺与PD-L1^-患者的生存曲线比较(P=0.005)

Figure  4  Survival curves of DEL patients with PD-L1⁺ and PD-L1^- (P=0.005)

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图  5  DEL组中mPD-L1⁺与mPD-L1^-患者的生存曲线比较(P=0.001)

Figure  5  Survival curves of DEL patients with mPD-L1⁺ and mPD-L1^- (P=0.001)

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3   讨论

尽管淋巴瘤的WHO分类还未将DEL单独列出, 但这类淋巴瘤和"双打击淋巴瘤"相类似, 在临床上具有独特的临床特点。多项研究^{[1-4, 12-14]}表明这类共表达淋巴瘤的IPI评分和肿瘤细胞增殖指数高, 常有多个结外部位累及, 患者在接受标准的R-CHOP免疫化疗方案治疗后复发率高, 且5年生存率也较低。因此, 发现这类DEL的理想预后评估因素和有效的治疗靶点有着重要意义。

PD-L1表达与T淋巴细胞的凋亡及活化有关, 其上调表达通过与浸润T细胞表面受体PD1的结合诱导效应T细胞凋亡、抑制T细胞活化, 从而产生肿瘤生长的微环境, 介导肿瘤细胞的免疫逃逸^[6-7]。PD-L1表达对大B细胞淋巴瘤影响的研究多集中在部位特点和细胞来源特点等方面。Kiyasu研究小组^[15]统计1 235例临床样本, 发现肿瘤细胞表达PD-L1在DLBCL中阳性率为11%, 微环境细胞PD-L1阳性表达率为15.3%, PD-L1及mPD-L1的表达与GCB样DLBCL和EB病毒阳性的大B细胞淋巴瘤病例显著相关, 且PD-L1⁺的患者总生存期(OS)低于PD-L1^-的DLBCL患者。Liu等^[16]检测92例原发肠道的弥漫大B细胞淋巴瘤样本中PD-L1的表达, 结果与Kiyasu研究小组的结果相似, 但微环境中PD-L1的阳性率相对较高。本研究发现PD-L1、mPD-L1在90例大B细胞淋巴瘤中的阳性表达率分别为24.44%和28.89%, 与Liu等的研究报道相近。

有研究报道^[17]DLBCL患者如果伴有PD-L1的DNA扩增、mRNA上调及蛋白高表达, 其生存预后均不理想, 且PD-L1蛋白表达并不完全由基因调控, 可能还受肿瘤环境中的其他因素影响。Casey团队^[9]发现MYC可以与PD-L1启动子结合, 直接调控PD-L1表达, 沉默MYC后PD-L1蛋白表达明显下降; Rossille研究结果^[18]表明, 在BCL2阳性侵袭性弥漫性大B细胞淋巴瘤患者中, 血清PD-L1高表达水平患者的总体生存期(OS)明显短于血清PD-L1低表达水平患者。本研究发现在MYC/BCL2共表达淋巴瘤中PD-L1、mPD-L1的阳性表达率明显高于非共表达大B细胞淋巴瘤, 且在该类淋巴瘤中PD-L1 mRNA相对表达量明显上调。既往报道和我们的结果都提示PD-L1与MYC/BCL2蛋白表达可能存在某种关联, 它们之间可能存在一些信号转导通路的"串话"。具体机制有待于进一步深入的分子、基因等方面研究探讨。

本研究统计DEL患者临床相关数据提示在DEL中PD-L1蛋白表达与高IPI评分和B症状的出现有关; 此外, 通过对28例DEL患者生存随访资料统计分析发现, DEL患者中PD-L1无论在肿瘤细胞表达还是在肿瘤微环境细胞中的表达, 患者OS均显著低于阴性组; 这些结果都提示, PD-L1蛋白的上调表达与DEL患者不良预后相关。

作为一项回顾性的研究, 本实验存在一定的缺陷:首先因受到总样本量收集的限制, 纳入研究样本量相对较小, 统计结果可能与大样本的研究结果会存在一定误差; 其次, 本实验部分RNA提取使用的组织为年份较长的石蜡组织, 可能提取RNA存在降解, 对实验也有一定的影响。因此, 还需扩大样本量、使用新鲜离体组织或提高各项检测技术等来验证我们的结果。

综上所述, MYC/BCL2共表达大B细胞淋巴瘤中PD-L1蛋白和mRNA均上调表达, 这可能与这类淋巴瘤不良预后有关, 它在这类淋巴瘤预后评估中的价值还有待于进一步研究证实。