0   引言

子宫内膜癌（endometrial cancer, EC）是常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率呈逐年递增趋势^[1]。EC主要通过手术治疗，辅以放疗和化疗，但是越来越多的EC患者出现化疗耐药情况^[2]。长链非编码RNA（long non-coding RNAs, lncRNAs）在肿瘤发生和发展过程中起到重要作用，如lncRNA HOTAIR高表达能够促进EC侵袭和转移^[3]。ZEB1-AS1与结直肠癌、胃癌和黑色素瘤等多种肿瘤的发生发展有关^[4-6]，但是既往鲜有其在EC中的报道，本研究旨在分析EC中ZEB1-AS1的表达及其与临床病理特征的关系，以期揭示其在EC发生和发展中所起的作用。

1   资料与方法

1.1   临床组织标本

收集2010年1月—2016年12月郑州大学第三附属医院医院病理科的195对子宫内膜癌-癌旁正常组织标本。所有患者手术前均未接受放疗或化疗，平均年龄56.7±11.6岁，课题组每6月进行一次电话随访，随访截至2019年1月，最长随访95月，最短1月，中位随访时间为32月。患者相互之间无亲缘关系。

1.2   实时荧光定量PCR

使用ABI 7900HT型PCR仪，Master Mix为美国ABI公司配套试剂, 并严格按照说明书配置相关反应体系，2^-ΔΔCt法分析qRT-PCR结果；GAPDH作为内参；肿瘤组织相对表达量大于等于中位数（中位数=0.007）为高表达，反之为低表达。

1.3   细胞与试剂

EC细胞系Ishikawa购自中国科学院上海细胞库。使用含10%FBS的DMEM培养基（深圳市百恩维生物科技有限公司），37℃、5%CO₂饱和湿度条件下进行培养。细胞裂解液TRIzol购自美国Invitrogen公司，反转录试剂盒购自日本TaKaRa公司。胎牛血清购自上海逍鹏生物科技有限公司；ZEB1-AS1过表达质粒购自上海吉凯基因科技有限公司，转染试剂Lipofectamine 3000购自美国Life Technologies公司；引物于生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4   稳转细胞系筛选

选取过表达ZEB1-AS1的EC细胞。转染试剂为Lipofectamine 3000（Invitrogen），操作步骤严格按照说明书进行。

1.5   MTT实验

消化重悬对数生长期细胞，按200个细胞/孔浓度接种于96孔板中，每组设置5个平行实验孔，同时接种5个相同的96孔板用于不同时间点检测（0、12、24、36和48 h）。按试剂说明书配置溶液，加入DMSO 2 h后于450 nm波长下检测其吸光度值（OD）。

1.6   Transwell实验

采用Transwell迁移和侵袭实验检测ZEB1-AS1过表达后对EC细胞迁移和侵袭能力的影响。细胞融合度达到70%~80%时接种于8 μm孔径的小室中，每孔3×10⁴个细胞，每组设置4个复孔。待接种48 h后使用甲醛固定、0.1%结晶紫染液染色，使用倒置相差显微镜随机选取5个视野拍照、计数。

侵袭实验操作步骤同迁移实验，但小室为预先铺设基质胶。

1.7   统计学方法

使用SPSS20.0软件对数据进行统计分析，采用配对t检验分析癌组织和对应癌旁正常组织中ZEB1-AS1表达水平的差异，采用χ²检验和独立样本t检验分析不同EC患者临床特征及疾病进展中ZEB1-AS1表达水平的差异，采用K-M法绘制生存曲线，Log rank检验不同组患者生存时间的差异。独立t检验分析细胞迁移和侵袭能力差异；采用重复测量的方差分析方法分析MTT实验中细胞增殖能力的差异。所有检验均为双侧检验，α=0.05，P < 0.05为差异有统计学意义。

2   结果

2.1   ZEB1-AS1在EC组织中的表达

ZEB1-AS1在EC组织中的表达量显著高于癌旁正常组织（0.0074±0.0276 vs. 0.0033±0.0135, P=0.029），见图 1。

图  1  子宫内膜癌和癌旁正常组织中ZEB1-AS的表达

Figure  1  Expression of ZEB1-AS in endometrial cancer and adjacent normal tissues

EC: endometrial cancer

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2.2   ZEB1-AS1表达水平与EC患者临床病理特征之间的关系

ZEB1-AS1表达水平（将肿瘤组织中ZEB1-AS1相对表达量中位数及以上的分为高表达组，反之为低表达组）与EC患者家族肿瘤史、病理分级、病理分型、化疗、肿瘤分期、T分期、M分期和HPV感染相关（均P < 0.05），见表 1。

表  1  ZEB1-AS1表达水平与EC临床特征之间的关系(n(%))

Table  1  Relation between ZEB1-AS1 expression and clinical characteristics of endometrial cancer patients (n(%))

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2.3   ZEB1-AS1高表达与EC患者生存期的关系

ZEB1-AS1低表达组中位生存时间为46月，高表达组中位生存时间为33月，ZEB1-AS1高表达组OS明显低于ZEB1-AS1低表达组（χ²=7.736, P=0.0054），见图 2。

图  2  ZEB1-AS1的表达与EC患者生存期的关系

Figure  2  Relation between ZEB1-AS1 expression and survival of EC patients

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2.4   ZEB1在EC组织中的表达

ZEB1在EC组织中的表达量显著高于癌旁正常组织（0.0115±0.0338 vs. 0.0071±0.0200, P=0.044），见图 3A。EC组织中ZEB1-AS1相对表达量与ZEB1相对表达量呈正相关（r=0.505, P < 0.001），见图 3B。

图  3  ZEB1在EC组织中的表达(A)及其与ZEB1-AS1表达的关系(B)

Figure  3  ZEB1 expression in EC tissues(A) and its correlation with ZEB1-AS1 expression(B)

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2.5   ZEB1表达水平与EC患者临床病理特征的关系

将肿瘤组织中ZEB1相对表达量中位数及以上的分为高表达组，反之为低表达组。ZEB1表达水平与EC患者家族肿瘤史、病理分级、肿瘤分期、T分期、N分期和M分期相关（P < 0.05），见表 2。

表  2  ZEB1表达水平与EC临床特征之间的关系(n(%))

Table  2  Relation between ZEB1 expression and clinical characteristics of EC patients (n(%))

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2.6   ZEB1高表达与EC患者生存期的关系

ZEB1低表达组中位生存时间为48月，高表达组中位生存时间为35月，ZEB1高表达组OS明显低于ZEB1低表达组（χ2=4.736, P=0.00295），见图 4。

图  4  ZEB1的表达与EC患者生存期的关系

Figure  4  Relation between ZEB1 expression and survival of EC patients

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2.7   过表达ZEB1-AS1对EC细胞增殖的影响

当细胞增殖24 h以后，过表达细胞系增殖能力明显较对照细胞系强。转染24、36和48 h时表达组OD值分别为0.435±0.035、0.581±0.068、0.824±0.090，均高于对照组0.370±0.049、0.438±0.075、0.625±0.043（P=0.044、0.013、0.002），见图 5。结果表明ZEB1-AS1能够明显促进EC细胞的增殖。

图  5  ZEB1-AS1的表达对EC细胞增殖的影响

Figure  5  Effect of ZEB1-AS1 expression on proliferation of EC cells

*: P < 0.05, **: P < 0.01, ZEB1-AS1 overexpression group vs. control group

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2.8   过表达ZEB1-AS1可促进EC细胞迁移

过表达组EC细胞迁移能力明显较对照细胞强（74.2±6.4 vs. 52.1±11.6, P < 0.001），见图 6。

图  6  ZEB1-AS1的表达对EC细胞迁移能力的影响(×200)）

Figure  6  Effect of ZEB1-AS1 expression on migration of EC cells (×200)

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2.9   过表达ZEB1-AS1可促进EC细胞侵袭

过表达组EC细胞侵袭能力明显较对照细胞强（61.4±8.2 vs. 45.1±8. 1, P < 0.001），见图 7。

图  7  ZEB1-AS1的表达对EC细胞侵袭能力的影响(×200)

Figure  7  Effect of ZEB1-AS1 expression on invasion of EC cells (×200)

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3   讨论

雌激素水平、月经初潮时间、绝经时间等是EC的危险因素^[7]。EC的治疗以手术为主，放疗和化疗为辅，但治疗效果和患者预后不尽如人意^[8]。已有研究表明，lncRNAs在肺癌、肝癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌等多种肿瘤的发生和发展中发挥抑癌基因或者促癌基因的作用^[9]。Wang等^[10]研究发现ZEB1-AS1在黑色素瘤中高表达，且与不良预后相关；Ma等^[11]报道ZEB1-AS1通过与miRNA形成ceRNA网络使胃癌不良预后。ZEB1-AS1在结直肠癌、胃癌和黑色素瘤等多种肿瘤中发挥促癌作用^[4-6]，但是既往鲜有其在EC中所起作用的报道。

本研究发现，ZEB1-AS1在EC组织中的表达量显著高于对应癌旁正常组织，且ZEB1-AS1高表达与EC患者家族肿瘤史、病理分级、肿瘤分期、化疗、TNM分期相关，ZEB1-AS1高表达使EC患者生存期缩短，提示ZEB1-AS1在EC发生和发展过程中发挥促癌基因的作用。李晓丽等^[12]也发现ZEB1-AS1的表达与HPV感染和化疗相关。本研究进一步通过慢病毒稳转细胞系检测过表达ZEB1-AS1对EC细胞系增殖、迁移和侵袭能力的影响，发现ZEB1-AS1高表达能够促进EC细胞系增殖、迁移和侵袭，提示ZEB1-AS1能够促进EC细胞生长、转移和侵袭。目前对于lncRNA的研究多集中于其与对应天然翻译转录基因的调控作用。Li等^[13]研究发现ZEB1-AS1在肝癌中通过与其靶基因ZEB1相互作用促进肝癌恶化，并预示肝癌患者不良预后。本研究发现ZEB1在EC中表达上调，且其相对表达量与ZEB1-AS1相对表达量成正相关，提示在EC中ZEB1-AS1可对ZEB1产生调控作用。但是本研究并未对ZEB1-AS1调控ZEB1的机制进行深入探讨，这是本研究的局限性之一。

张春云等^[14]研究发现ZEB1在子宫内膜异位症患者中表达上调。Peng等^[15]研究发现抑制ZEB1能够让KRAS突变的癌症对MEK抑制剂更加敏感。通过分析ZEB1相对表达量与EC患者临床特征的关系发现家族肿瘤史、病理分级、肿瘤分期、T分期、N分期和M分期相关，且ZEB1高表达也使EC患者生存期缩短，提示ZEB1在EC发生和发展过程中亦发挥促癌基因的作用，这与既往研究结果相似。

本研究发现ZEB1-AS1通过调控ZEB1在EC中的表达，对EC的发生和发展产生调控作用，但尚未能进一步解释其调控的分子机制，是本研究的不足之处。但仍可证实ZEB1-AS1和ZEB1可作为EC治疗潜在的生物靶标。