0   引言

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma, NPC）起源于鼻咽部黏膜上皮组织和腺体，多为低分化鳞状细胞癌，恶性程度高且易转移和复发，是我国南方（广东、广西、福建、湖南和江西等）及东南亚地区较为常见的恶性肿瘤^[1]。尽管目前手术联合放化疗显著提高了鼻咽癌的治疗效果，但是，中晚期鼻咽癌患者的5年生存率仍低于60%，且预后较差^[2-4]。因此，深入研究鼻咽癌的发生与发展机制，寻找新的治疗方法，对改善患者治疗效果和预后具有重要意义。

Sestrin2是应激诱导蛋白Sestrins家族的重要成员，是一种进化上高度保守的蛋白^[5]。在DNA损伤、氧化应激、内质网应激等损伤因子的作用下，Sestrin2可通过调控腺苷酸激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）这两大信号通路维持细胞稳态^[6]。多项研究表明Sestrin2表达下调与多种恶性肿瘤相关，包括结直肠癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、骨肉瘤等^[7]。然而，Sestrin2在鼻咽癌发生发展中的作用及其机制尚不清楚。本研究首先检测了Sestrin2在鼻咽癌患者肿瘤和癌旁组织的表达，继而通过pcDNA3.1/Sestrin2转染鼻咽癌CNE-1细胞，观察过表达Sestrin2对CNE-1细胞增殖和凋亡的影响，以期为鼻咽癌的治疗提供新的靶点及理论依据。

1   资料与方法

1.1   临床标本收集

收集2016年1月—2018年2月湖北省肿瘤医院收治的46例鼻咽癌及相应癌旁正常组织标本。所有患者均行病理活检，且活检前未接受放、化疗，结合临床表现和鼻咽部CT检查确诊为鼻咽部鳞状细胞癌。排除标准：（1）年龄 < 18岁或 > 75岁；（2）合并其他部位的原发性肿瘤或转移癌；（3）严重的感染性疾病及免疫功能障碍者；（4）妊娠期和哺乳期女性；（5）精神异常患者等。其中有3例因合并其他部位的原发性肿瘤或转移癌、1例因合并严重的感染性疾病及免疫功能障碍、1例因妊娠期排除，最终纳入41例患者；所有标本的收集均获得患者的知情同意，并通过湖北省肿瘤医院伦理委员会审核批准。

1.2   试剂

人鼻咽癌鳞癌细胞株CNE-1购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，pcDNA3.1/Sestrin2质粒由上海吉凯基因化学技术有限公司合成和鉴定。RNA提取试剂盒和CCK-8试剂盒购自美国Thermo公司。TRIzol、反转录试剂盒和细胞凋亡检测试剂盒均购自德国Roche公司。LipofectamineTM2000转染试剂盒和RPMI 1640培养基购自美国Invitrogen公司。兔抗人Sestrin2抗体、兔抗p-AMPK抗体、兔抗人AMPK抗体、兔抗人p-mTOR抗体、兔抗人mTOR抗体和兔抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）抗体均购自美国Abcam公司。

1.3   实验方法

1.3.1   免疫组织化学染色

4%的多聚甲醛固定标本，石蜡包埋后将蜡块切成4 μm厚的组织切片。放入二甲苯后酒精梯度脱蜡，再放入微波炉中进行抗原修复，用3%双氧水溶液阻断内源性过氧化物酶。3%小牛血清封闭后加入Sestrin2抗体和二抗，待切片显色后苏木精对比染色细胞核，脱水封片后显微镜下观察并采集图片。Sestrin2阳性表达物定位于细胞内，细胞内出现棕黄色颗粒者为阳性细胞。免疫组织化学结果判断：阳性细胞数 < 10%为（-），阳性细胞数10%~25%为（+），阳性细胞数≥25%~50%为（++），阳性细胞数≥50%为（+++）。将（-）归为阴性表达，（+）~（+++）归为阳性表达。

1.3.2   细胞培养及转染

将人鼻咽癌CNE-1细胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，培养于5%CO2、37℃的培养箱。待细胞培养至对数期时，利用脂质体LipofectamineTM²⁰⁰⁰转染CNE-1细胞。将细胞分为三组：未处理组（正常CNE-1细胞）、阴性对照组（转染空载体pcDNA3.1）和转染组（转染pcDNA3.1/Sestrin2）。

1.3.3   RT-PCR法检测Sestrin2 mRNA水平

转染后的CNE-1细胞培养48h后利用TRIzol法提取总RNA，用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，利用罗氏Lightcycler480 RT-PCR仪进行扩增。反应条件为：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火1 min，共40个循环，72℃延伸10 min。以GAPDH作为内参，对RT-PCR结果进行定量分析。利用Primer-BLAST在线设计引物，特异性引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。GAPDH上游引物序列为5' -CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3' ，下游引物序列为5' -AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3' 。Sestrin2上游引物：5' -TCTTACCTGGTAGGCTCCCAC-3' ，下游引物：5' -AGCAACTTGTTGATCTCGCTG-3' 。实验重复3次，取均值。

1.3.4   Western blot法检测Sestrin2蛋白水平

细胞蛋白提取试剂盒提取总蛋白，二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid, BCA）法进行总蛋白浓度和定量检测。制备十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶，每孔加入50 µg的蛋白样品，75 V恒压电泳30 min后，100 V恒压电泳2 h。待电泳结束后，湿转法将蛋白电转移到PVDF膜上，5%牛血清白蛋白封闭60 min后，加入相应的一抗，4℃孵育过夜。随后二抗室温孵育1 h，利用Odyssey双色红外激光成像系统扫膜，以GAPDH为内参，分析目的蛋白表达水平。实验重复3次，取均值。

1.3.5   CCK-8法检测细胞增殖活性

取对数生长期细胞接种到96孔培养板中，调整细胞密度为5×10³个每孔。每孔中加入10 µl的CCK-8溶液后37℃孵育4 h，移除上清液，加入150 µl的二甲基亚砜溶液，37℃孵育10 min，酶标仪检测450 nm波长处每孔的吸光度值（OD值）。实验重复3次，取均值。

1.3.6   流式细胞术检测细胞凋亡

将处于对数生长期的细胞接种于6孔板中培养48 h，收集细胞后弃上清液。200 μl的结合缓冲液重悬细胞，5 μl膜联蛋白V-FITC（Annexin V-FITC）和5 μl碘化丙啶（PI）染色液，37℃避光孵育15 min后，加入150 µl的缓冲液，流式细胞仪检测细胞凋亡水平。实验重复3次，取均值。

1.4   统计学方法

采用SPSS 21.0软件进行统计学处理。计量数据以均数±标准差表示，非参数检验采用Mann-Whitney U检验，多组比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2   结果

2.1   Sestrin2在鼻咽癌及癌旁正常组织中的表达

免疫组织化学结果显示鼻咽癌及癌旁正常组织均有Sestrin2的表达，且肿瘤组织Sestrin2的表达量明显低于癌旁正常组织，差异有统计学意义（P=0.00241），见图 1。

图  1  鼻咽癌组织与癌旁正常组织中Sestrin2的表达(×200)

Figure  1  Sestrin2 expression in nasopharyngeal carcinoma and adjacent normal tissues (×200)

^*: P<0.05, compared with adjacent normal tissues

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2.2   Sestrin2的表达与鼻咽癌患者临床参数的关系

Sestrin2的低表达与TNM分期（P=0.036）、淋巴结转移（P=0.018）相关，而与性别（P=0.781）和年龄（P=0.865）无关，见表 1。

表  1  Sestrin2的表达与鼻咽癌患者临床参数的关系

Table  1  Correlation of Sestrin2 expression with clinicopathological parameters of nasopharyngeal carcinoma patients

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2.3   CNE-1细胞Sestrin2过表达的鉴定

RT-PCR和Western blot法结果显示，转染组CNE-1细胞中Sestrin2 mRNA和蛋白表达明显高于未处理组和阴性对照组，差异有统计学意义（均P=0.000），而未处理组和阴性对照组相比，差异无统计学意义（P > 0.05），见图 2、表 2。

图  2  Western blot法检测转染后Sestrin2蛋白水平

Figure  2  Sestrin2 protein level after transfection detected by Western blot

1: Control group; 2: Negative control group; 3: Transfection group

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表  2  转染后CNE-1细胞中的Sestrin2 mRNA和蛋白相对表达量(n=6)

Table  2  Relative expression of Sestrin2 mRNA and protein in transfected CNE-1 cells (n=6)

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2.4   细胞增殖活性检测结果

CCK-8实验结果显示，Sestrin2转染组细胞生长速度明显低于未处理组和阴性对照组，差异有统计学意义（P=0.000），而未处理组和阴性对照组相比，差异无统计学意义（P > 0.05），见图 3。

图  3  CCK-8法检测Sestrin2过表达对人鼻咽癌细胞增殖能力的影响

Figure  3  Effect of Sestrin2 overexpression on proliferation of human nasopharyngeal carcinoma cells detected by CCK-8 assay

^*: P<0.05, compared with Control and Negative control groups

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2.5   细胞凋亡检测结果

流式细胞术检测结果显示Sestrin2转染组细胞凋亡率（（45.6±4.24）%）显著高于未处理组（（11.8±1.35）%）和阴性对照组（（10.3±1.26）%），差异有统计学意义（P=0.000），而未处理组和阴性对照组相比，差异无统计学意义（P > 0.05），见图 4。

图  4  流式细胞术检测CNE-1细胞凋亡情况

Figure  4  Apoptosis of nasopharyngeal carcinoma cells detected by flow cytometry

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2.6   AMPK和mTOR蛋白水平检测

Western blot法检测Sestrin2过表达对AMPK和mTOR通路的影响，结果显示相较于未处理组和阴性对照组，Sestrin2转染组细胞AMPK磷酸化水平显著升高，而mTOR磷酸化水平显著降低，差异均有统计学意义（均P=0.000）。而未处理组和阴性对照组相比，差异无统计学意义（P > 0.05），见表 3、图 5。

表  3  三组细胞蛋白相对表达量(n=6)

Table  3  Relative expression of proteins in nasopharyngeal carcinoma cells in three groups(n=6)

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图  5  Western blot法检测转染后AMPK和mTOR蛋白水平

Figure  5  Expression levels of AMPK and mTOR proteins after transfection detected by Western blot

1: Control group; 2: Negative control group; 3: Transfection group

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3   讨论

鼻咽癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，具有明显的种族差异和地域分布特点，患者病死率高且预后较差。因此，寻找新的治疗靶点和干预方式，对改进患者的治疗方式和改善预后具有重要意义。本研究首先检测了Sestrin2在鼻咽癌患者肿瘤和癌旁组织的表达，免疫组织化学结果提示Sestrin2在鼻咽癌组织表达降低，且Sestrin2低表达与TNM分期、淋巴结转移和肿瘤复发情况密切相关，这些结果表明，Sestrin2表达下调可能与鼻咽癌肿瘤的发生发展相关。继而我们选用经典鼻咽癌细胞系CNE-1细胞为研究对象，通过pcDNA3.1/Sestrin2转染鼻咽癌CNE-1细胞，RT-PCR和Western blot结果提示转染组细胞Sestrin2的mRNA和蛋白水平显著高于未处理组和阴性对照组，这些结果表明我们成功构建了稳定表达Sestrin2的鼻咽癌CNE-1细胞。

Sestrin2，又称为低氧诱导基因95（Hi95），其编码基因位于人类6号染色体的长臂21位点。2002年，Budanov等^[8]首次将Sestrin2从人脑胶质母细胞瘤A172细胞中克隆出来，并证实其在多种组织中表达。Sesntrin2包含2个呈对称分布、在结构上类似的功能域，其N末端可还原烷基过氧化物，而C末端可抑制mTOR。既往研究提示Sestrin2在多种类型肿瘤的发生发展中起着重要的作用^[6]。Seo等^[9]证实5-氟尿嘧啶可通过上调Sestrin2的表达促进结肠癌细胞的凋亡。Tong等^[10]的研究结果表明迷迭香酸提取物可通过上调Sestrin2的表达，抑制人肝癌HepG2细胞的增殖能力，进而促进HepG2细胞的凋亡。本研究中，我们利用CCK-8法观察Sestrin2过表达对鼻咽癌CNE-1细胞增殖能力的影响，流式细胞仪检测Sestrin2过表达对鼻咽癌CNE-1细胞凋亡水平的影响。和既往研究一致，本研究结果表明Sestrin2过表达可抑制鼻咽癌CNE-1细胞的增殖活性，诱导鼻咽癌CNE-1细胞的凋亡，这些结果提示Sestrin2可能是干预和治疗鼻咽癌的重要靶点。

我们进一步研究了Sestrin2过表达调控鼻咽癌细胞增殖和凋亡的下游信号分子。AMPK是一种由异源三聚体构成的蛋白复合物，包括α催化亚基、β和γ调节亚基。当AMP/ATP升高时，AMP与γ调节亚基结合引起构象改变，从而诱导AMPK磷酸化，调控能量物质代谢^[11]。Wei等^[12]研究表明，Sestrin2过表达可通过激活AMPK通路，抑制结直肠癌细胞的增殖，进而诱导结直肠癌细胞的凋亡。mTOR是一种相对分子质量为289 kD的丝/苏氨酸蛋白激酶，其编码蛋白由2 549个氨基酸组成。mTOR可通过整合多种细胞外信号，包括生长因子、能量、营养等，参与核糖体转录，蛋白质翻译和细胞凋亡等多种病理生理过程^[13]。Wang等^[14]表明，Sestrin2过表达可通过激活AMPK，抑制mTOR的活性，促进卵巢癌细胞的凋亡。本实验结果表明，Sestrin2过表达后的鼻咽癌中AMPK磷酸化水平升高，而mTOR磷酸化水平降低，提示过表达Sestrin2可通过激活AMPK通路，抑制mTOR通路，从而诱导鼻咽癌CNE-1细胞凋亡。

综上所述，Sestrin2在鼻咽癌组织表达下调，且Sestrin2低表达与TNM分期、淋巴结转移和肿瘤复发情况密切相关。上调Sestrin2的表达通过激活AMPK磷酸化，抑制mTOR磷酸化，抑制鼻咽癌细胞生长，促进鼻咽癌细胞的凋亡。本研究为防治鼻咽癌提供了新的靶点和实验基础。然而，Sestrin2调控AMPK和mTOR信号通路的具体机制还有待进一步研究。此外，本研究没有在多种鼻咽癌细胞中进行验证，也没有进行体内实验，下一步我们将就此继续探讨。