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摘要:目的
观察体外基因干预后HIF-1α和VEGF表达的变化，从而探讨HIF-1α在胶质瘤血管新生调控中所起的作用。
方法CoCl2化学缺氧法模拟肿瘤缺氧环境，反转录聚合酶链式反应（qPCR）、免疫荧光法、Western blot法和ELISA双抗体夹心法比较基因干预HIF-1α前后，胶质瘤A172细胞相关mRNA和蛋白表达量变化。
结果缺氧环境下HIF-1α mRNA表达未见明显变化，VEGF mRNA表达明显增多；缺氧培养8、16、24 h，HIF-1α及VEGF蛋白表达依次增多。基因干预成功后缺氧培育24 h，HIF-1α及VEGF蛋白表达明显减少，与未转染组比较，转染抑制率分别是86.3%和78.9%，VEGF mRNA表达抑制率是81.5%。
结论siRNA干预抑制HIF-1α表达后VEGF表达明显减少。缺氧促使A172细胞HIF-1α在蛋白水平表达升高，HIF-1α通过转录激活VEGF促进胶质瘤缺氧状态下的血管新生。
Abstract:ObjectiveTo observe the changes of hypoxia induction factor-a(HIF-α) and vascular endothelial growth factor(VEGF) expression after in vitro gene intervention, so as to explore the role of HIF-1α in the regulation of angiogenesis in glioma.
MethodsCoCl2 chemical hypoxia method simulated tumor hypoxia environment, and reverse transcription polymerase chain reaction (qPCR), immunofluorescence method, Western blot method and ELISA double antibody sandwich method were used to compare the expression levels of related mRNA and protein in glioma A172 cells before and after gene intervention of HIF-1α.
ResultsHIF-1α mRNA expression was not significantly changed under hypoxia, and VEGF mRNA expression was significantly increased. The protein expressions of HIF-1α and VEGF were increased successively in hypoxic culture at 8, 16 and 24 hours. After successful gene intervention in hypoxia culture for 24 hours, HIF-1α and VEGF protein expressions were significantly reduced. Compared with the untransfected group, the inhibition rates of transfection were 86.3% and 78.9% respectively, and the inhibition rate of VEGF mRNA expression was 81.5%.
ConclusionVEGF expression is significantly reduced after HIF-1α expression is inhibited by siRNA intervention. The protein expression of HIF-1α in A172 cells is increased in the hypoxic environment, and HIF-1α promotes angiogenesis in glioma under hypoxia through transcriptional activation of VEGF.
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Key words:
- Glioma /
- HIF-α /
- VEGF /
- Genetic intervention
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0 引言
肿瘤干细胞（tumor stem cell, TSC）学说的提出对肿瘤的发生、发展和治疗作出了新的诠释[1-2]。正常干细胞的功能需要周围的微环境来维持，肿瘤干细胞的功能同样也受到肿瘤微环境的影响。肿瘤在生长过程中会招募各种类型的免疫细胞到肿瘤微环境中去，并且这些免疫细胞在肿瘤细胞的作用下表型与功能都发生了改变，从而促进肿瘤生长和转移[3-4]。这些浸润在肿瘤组织当中的免疫细胞能够分泌大量的炎性因子，例如HMGB1、IL-6、IL-8、TNF等，正是由于这些炎性细胞与其所分泌的活性因子形成了肿瘤干细胞赖以生成的微环境，这些炎性因子刺激与保护肿瘤干细胞以维持其自我更新的能力，使非肿瘤干细胞向肿瘤干细胞转化[5]。其中高迁移率族蛋白（high-mobility group box-1，HMGB1）在骨髓衍生干细胞中作为损伤组织迁移目标可以促进组织修复[6]，在造血干细胞中HMGB1参与调控信号轴介导的造血干细胞归巢[7]，在胚胎干细胞HMGB1促进胚胎干细胞的迁移运动[8]，故HMGB1可能与多种干细胞的募集和增殖分化密切相关。
目前关于HMGB1在宫颈癌中是否能通过影响肿瘤干细胞标志物Nanog、OCT4和Sox2表达，从而调控宫颈肿瘤的干性尚不清楚。为此，我们利用Western blot和流式细胞仪检测干预HMGB1表达前后干细胞标志物Nanog、OCT4和Sox2表达变化，并通过免疫组织化学方法在临床样本中检测HMGB1、Nanog、OCT4和Sox2的表达，为探索宫颈肿瘤干细胞的调控机制和宫颈肿瘤的治疗提供理论基础。
1 资料与方法
1.1 资料
1.1.1 样本
宫颈癌SiHa和HeLa细胞株由武汉大学中南医院科学研究中心保存；宫颈癌组织标本来自于湖北医药学院附属襄阳医院妇产科2014年1月—2017年2月住院手术患者66例，其中宫颈鳞癌标本35例，慢性宫颈炎标本31例。获得患者知情同意，术后标本经液氮处理后立即保存于-70℃低温冰箱中。
1.1.2 试剂与材料
兔抗人HMGB1、（OCT4、Sox2和Nanog）多克隆抗体均购自Abcam公司；DMEM高糖培养基购自美国Hyclone公司；10%胎牛血清购自美国Gibco公司；Lipo2000购自美国Invitrogen公司；HMGB1载体构建、HMGB1特异性干扰siRNA及其对照片段由纽赛科生物科技（武汉）有限公司设计及合成。
1.2 方法
1.2.1 HMGB1载体的构建及鉴定
HMGB1通过化学合成的方式获得；通过T4 DNAligase将合成获得的HMGB1片段与GV230载体连接后，转化、涂LA平板，挑取单克隆行菌液PCR鉴定。
1.2.2 HMGB1过表达质粒验证和siRNA-HMGB1效率验证
（1）细胞培养与转染SiHa和HeLa细胞均在37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。分别将两种细胞传至6孔板中，待细胞培养到粘合度达到90%以上时，采用脂质体转染技术，按照Lipo2000说明书进行转染，转染6 h后，更换培养基，24 h后加G418继续培养，待细胞增殖后备用。（2）过表达质粒与干扰效率的检验经过多次反复实验，本次实验收集转染48 h后细胞，利用Trizol提取实验组、对照组及空白组细胞总RNA，按照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit说明书反转录成cDNA，经qRT-PCR检测HMGB1 mRNA表达变化；收集转染72 h后细胞，RIPA法裂解提取HMGB1 siRNA组、对照组及空白组细胞总蛋白，以HMGB1为一抗，经Western blot检测干扰HMGB1表达效率最高的siRNA序列。
1.2.3 Western blot和流式细胞术分别检测HMGB1上调（或抑制）表达后对干细胞标志物表达
（1）Western blot检测OCT4、Sox2和Nanog蛋白表达水平：收集转染72 h后的SiHa和HeLa细胞，100 μl裂解液冰上裂解30 min，13 000 r/min，4℃离心得到裂解上清液。BCA法测定蛋白浓度，经10%SDS-PAGE凝胶电泳后转移至PVDF膜，TBST配制5%脱脂奶粉，室温封闭1 h，用封闭液按OCT4（1:2 000）、Sox2（1:2 000）、Nanog（1:2 000）稀释抗体，4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次5 min，加入二抗室温孵育1 h，TBST洗膜3次显影。（2）FACS检测OCT4、Sox2和Nanog蛋白表达水平：SiHa和HeLa细胞接种至6孔板中，接种密度为1×105个细胞，每孔加入1 ml培养液；依据分组对细胞给药，24 h处理细胞；将细胞用胰酶消化后，收集细胞悬液1 000 r/min离心3 min；4℃ PBS洗涤2次；用4%多聚甲醛室温固定40 min，1 000 r/min 5 min去上清液，最后用PBS调整细胞浓度，混匀；加入NTI-OCT4-FITC，ANTI-Sox2-PE，ANTI-Nanog-PE 4℃ 40 min；100 μl PBS洗涤后，1 000 r/min 5 min离心，冷PBS溶液洗涤细胞，取200 μl单核细胞悬液，流式上机检测，CELL Quest软件分析。
1.2.4 免疫组织化学检测宫颈鳞癌细胞中HMGB1、Sox2、OCT4和Nanog的表达
标本经10%甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，常规SP法免疫组织化学染色。一抗HMGB1、Sox2、OCT4和Nanog的工作浓度为1:100、1:100和1:20，实验步骤严格按照SP二步法试剂盒说明书进行。已知阳性切片作为阳性对照，PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。
1.3 统计学方法
采用SPSS22.0统计软件对数据进行统计分析，实验均重复3次，实验数据用“均值±标准差”表示，两样本均数的比较采用t检验，相关性分析采用Spearman等级相关法，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 HMGB1质粒载体的构建及鉴定
化学合成HMGB1 cDNA片段与预期648 bp大小一致，见图 1A；HMGB1 cDNA与GV230真核表达系统连接并鉴定，见图 1B；经测序分析重组载体序列正确，且质量符合设计标准。
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图 1 HMGB1质粒载体的构建及鉴定A: a chemosynthesis sequence of HMGB1 in gel electrophoresis; M: DS5000; B: 1-2 negative control; 3: positive control; 4: DS5000; 5-12: amplification products of HMGB1Figure 1 Construction and identification of HMGB1 plasmid vector2.2 HMGB1过表达质粒验证和siRNA-HMGB1效率验证
荧光定量PCR结果和Western blot结果显示，成功转染了质粒GV230-HMGB1的宫颈癌细胞中HMGB1 mRNA和蛋白表达水平较对照组和空载体组明显上升（t=20.59, t=13.63; t=22.59, t=13.75;均P < 0.001），见图 2A；另外将宫颈癌细胞中的HMGB1基因通过siRNA干扰后，可以发现siRNA- HMGB1组中mRNA和蛋白表达较对照组和空白组显著减少（t=11.31, t=16.97: t=22.94, t=20.28；均P < 0.001），见图 2B。
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图 2 HMGB1过表达质粒验证和siRNA-HMGB1效率验证***: P < 0.001; A: the relative expression of HMGB1 mRNA and protein in different groups, including control group, negative group and HGBM1 overexpression group; B: different interference efficiency of HMGB1 siRNAs，including control group, negative group and siRNA-HMGB1-(1/2/3) group; NC: negative controls; CK: control checkFigure 2 Identification of HMGB1 overexpressed plasmid and efficiency of siRNA-HMGB12.3 Western blot检测HMGB1对干细胞标志物Nanog、OCT4和Sox2蛋白表达的影响
与空载体组和阴性对照相比，HMGB1过表达的SiHa和Hela细胞中，Nanog（t=9.009，t=9.402；t=11.60，t=11.09；均P < 0.001）、OCT4（t=12.50，t=12.68；t=15.11，t=16.17；均P < 0.001）和Sox2（t=18.81，t=15.53；t=16.04，t=15.36；均P < 0.001）蛋白的表达明显升高；HMGB1低表达时Nanog（t=9.013，t=9.176；t=1.67，t=10.14；均P < 0.001）、OCT4（t=13.30，t=12.77；t=11.68，t=10.76；均P < 0.001）和Sox2（t=14.87，t=16.95；t=9.645，t=10.04；均P < 0.001）蛋白的表达显著降低，见图 3。说明HMGB1可影响Nanog、OCT4和Sox2蛋白的表达。
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图 3 HMGB1对干细胞标志物表达水平的影响T-low: low HMGB1 expression; T-over: HMGB1 overexpression. ***: P < 0.001, compared with empty vector and negative control groupFigure 3 Effect of HMGB1 on expression of Nanog, Oct4 and Sox2 detected by Western blot利用FACS检测肿瘤干细胞标志物的比例，实验显示，与空载体和HMGB1低表达组相比，HMGB1过表达组中干细胞标志物的表达明显增高（P < 0.05），说明HMGB1可以影响干细胞标志物OCT4、Sox2和Nanog的表达。与此同时，与空载体和HMGB1过表达组相比，HMGB1低表达组中干细胞标志物的表达均明显降低（P < 0.05），见图 4。说明HMGB1可以影响干细胞标志物OCT4、Sox2和Nanog的表达。
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图 4 HMGB1对干细胞表面标志物表达的影响Figure 4 Effect of HMGB1 on expression of cell surface markers detected by FACS2.4 HMGB1、Nanog、OCT4和Sox2在宫颈癌及慢性宫颈炎组织中的表达
HMGB1、Nanog、OCT4和Sox2主要表达于宫颈鳞癌细胞胞核，细胞质中少有表达，阳性染色呈棕黄色至棕褐色颗粒状，在慢性宫颈炎中有少量阳性染色，或呈微弱着色，见图 5。HMGB1、Nanog、OCT4和Sox2在慢性宫颈炎和宫颈癌中的阳性表达率分别为6.45%（2/31）和48.6%（17/35），12.9%（4/31）和57.1%（20/35）9.67%（3/31）和62.9%（22/35）, 9.67%（3/31）和54.3%（19/35），差异有统计学意义（P < 0.05）。
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图 5 HMGB1、Nanog、OCT4和Sox2在宫颈癌和慢性宫颈炎中的表达(SP×200)Figure 5 Expression of HMGB1, Nanog, OCT4 and Sox2 in cervical carcinoma and chronic cervicitis tissues(SP×200)2.5 HMGB1与Nanog、OCT4和Sox2表达的相关性
HMGB1蛋白在宫颈癌组织表达增高，Nanog、OCT4和Sox2蛋白表达也增高；HMGB1蛋白表达降低，Nanog、OCT4和Sox2蛋白在宫颈癌组织表达也降低。等级相关分析提示HMGB1的表达与Nanog、OCT4和Sox2的表达均呈正相关，见表 1。
表 1 宫颈癌中HMGB1与Nanog、OCT4和Sox2蛋白表达的相关性Table 1 Correlation between Nanog, OCT4, Sox2 and HMGB1 protein expression in cervical carcinoma tissues
3 讨论
肿瘤干细胞除了具有自我更新能力和多向分化潜能，还具有表达干细胞表面分子标志物的能力[9]。Nanog是目前公认的肿瘤干细胞标志性基因，在上皮恶性肿瘤形成过程中起关键作用，该基因去除或失活可在体内外抑制肿瘤细胞的致瘤性[10-11]。OCT4对维持干细胞正常发生过程中的自我更新具有极其重要的作用，是较强的干细胞标记物[12-13]。Sox2是胚胎发育的关键转录因子，在干细胞形成过程中起着至关重要的作用[14-15]。故Nanog、OCT4和Sox2是维持干细胞特性所必需的转录因子，也是识别和分选宫颈癌干细胞的分子表明标记。HMGB1是含量最丰富的HMG蛋白，其基因定位于人染色体13q12，调节转录过程[16]，在肿瘤侵袭过程中HMGB1可释放至细胞外，与细胞表面的HMGB1受体相结合形成相应复合物，激活丝裂原活化蛋白激酶、基质金属蛋白酶等信号通路，促进肿瘤新生血管形成肿瘤浸润及转移[17]。另有报道表明高细胞核HMGB1水平与血管转移密切相关，高细胞浆HMGB1的表达与淋巴结转移密切相关，可作为预测宫颈癌复发及预后的指标[18]。既往对宫颈癌细胞中HMGB1表达水平研究大多数着眼于上皮间质细胞转化的分子机制及其在肿瘤转移中的作用，尚未有关于在宫颈癌组织中HMGB1通过影响肿瘤干性基因从而调控宫颈癌干细胞样特性的明确报道。为此，我们利用分子克隆技术分别构建HMGB1过表达载体，以空载体组为对照组，选用两株不同宫颈癌细胞系（SiHa和HeLa）进行实验。通过Western blot检测，与空载体和低表达组相比，HMGB1过表达组中Nanog、OCT4和Sox2蛋白表达明显增加，用siRNA抑制HMGB1的表达后，Nanog、OCT4和Sox2蛋白的表达也降低，两组差异具有统计学意义，说明HMGB1可以影响干细胞标志物OCT4、Sox2和Nanog的表达。我们继续利用FACS检测肿瘤干细胞标志物OCT4、Sox2和Nanog表达，实验结果显示：与HMGB1低表达相比，过表达HMGB1组中干细胞标志物OCT4、Sox2和Nanog比例最高，这说明在HMGB1过表达的同时干细胞标志物OCT4、Sox2和Nanog的表达也随之上调，进一步说明它们之间有相关性。
本研究结果显示：在慢性宫颈炎组织中，HMGB1、Nanog、OCT4、Sox2大部分表达呈阴性，而宫颈鳞癌组织中均可见Nanog、OCT4、Sox2表达部分呈阳性，符合肿瘤干细胞在肿瘤组织中仅是部分表达的特征[19-20]。
本研究发现HMGB1对宫颈肿瘤干性基因在细胞水平上表达具有调控作用，从而提示HMGB1可能通过干性基因OCT4、Sox2和Nanog影响宫颈癌的干性，这将为宫颈癌细胞的干性研究提供理论基础。在后续的课题设计中，会在细胞和分子实验的基础上进一步探索HMGB1对干性基因在宫颈癌移植瘤模型中的作用。
作者贡献李钦：实验设计与实施，相关资料、数据的收集和统计分析，论文撰写与修改邱建武：指导实验设计和实施，审核相关数据和资料，指导论文撰写与修改 -
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图 1 qPCR法检测缺氧环境下A172细胞HIF-1α(A)和VEGF(B) mRNA表达情况
Figure 1 HIF-1α(A) and VEGF(B) mRNA expression in A172 cells under hypoxia detected by qPCR
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图 2 免疫荧光染色检测缺氧培养后A172细胞HIF-1α和VEGF蛋白表达情况(SP ×200)
Figure 2 Expression of HIF-1α and VEGF proteins in A172 cells cultured in hypoxia detected by immunofluorescence staining (SP ×200)
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图 3 qPCR法检测基因干预后A172细胞VEGF mRNA表达量变化
Figure 3 VEGF mRNA expression in A172 cells detected by qPCR after gene intervention
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图 4 免疫荧光染色检测基因干预后A172细胞HIF-1α、VEGF蛋白表达量变化(SP×200)
Figure 4 Changes of HIF-1α and VEGF protein expression in A172 cells after gene intervention detected by immunofluorescence staining (SP×200)
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图 5 Western blot法检测基因干预后A172细胞HIF-1α蛋白表达量变化
Figure 5 HIF-1α protein expression in A172 cells after gene intervention detected by Western blot
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