0   引言

食管癌是常见的消化道肿瘤，约占所有恶性肿瘤的2%，其病死率位居第4位^[1-3]。食管癌的治疗方式主要为手术治疗、化学治疗和放射治疗，但都存在不良反应强和预后差的缺点^[4]。因此，寻找安全、高效、低毒的治疗方法迫在眉睫。

隐丹参酮（cryptotanshinone）是从传统中药丹参根部分离出来的有效成分，分子式为C₁₉H₂₀O₃，作为菲醌类化合物，其骨架上具有邻醌或对醌结构，表现出抗菌、抗炎和抗肿瘤的药理活性^[5-6]。研究表明，隐丹参酮可以通过调控雌激素受体、ERK及AKT等蛋白有效抑制前列腺癌、胃癌、胆管癌及乳腺癌细胞的增殖并诱导其凋亡^[7-10]，在体内实验中发现，隐丹参酮也可通过诱导肝癌HepG2裸鼠移植瘤细胞发生凋亡进而抑制肿瘤细胞的增殖^[11]，但其对食管癌细胞的作用研究尚未见报道，我们猜测隐丹参酮可能对食管癌细胞也具有类似的作用。本实验将探究隐丹参酮对人食管癌HCE-4细胞的杀伤作用、诱导凋亡作用及分子机制，为食管癌以及其他癌症的治疗和新药开发提供新思路。

1   材料与方法

1.1   材料

1.1.1   细胞

人食管癌HCE-4和TE-2细胞系，人正常肝L-02和QSG-7701细胞系（中国科学院细胞研究所）。

1.1.2   主要试剂

隐丹参酮和DMSO（Sigma, 美国），5-氟尿嘧啶（Med Chem Express，美国），RPMI 1640培养液和FBS胎牛血清（Gibco，美国），青/链霉素双抗（Hyclone, 美国，SV30010），胰蛋白酶和磷酸盐缓冲液（Hyclone，美国），噻唑蓝（Amresco，美国），α-tubulin、Bad、Bcl-2、Caspase-3、PARP、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38、AKT、p-AKT抗体，HRP标记山羊抗兔IgG，HRP标记山羊抗鼠IgG（Santa Cruz，美国），活性氧检测试剂盒（Invitrogen，美国），Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（碧云天，中国），ECL化学发光试剂（Thermo，美国）。

1.2   方法

1.2.1   细胞培养

人食管癌HCE-4和TE-2细胞及人正常肝L-02和QSG-7701细胞用含10%胎牛血清、100 u/ml青霉素及100 µg/ml链霉素的RPMI 1640培养液，在37℃、5%CO₂饱和湿度的培养箱中培养。待细胞密度达到70%~80%时，按照比例进行传代培养。

1.2.2   MTT比色法检测细胞存活率

收集处于对数生长期的食管癌HCE-4和TE-2细胞及正常肝L-02和QSG-7701细胞，制成细胞数为每毫升1×10⁵个的细胞悬液，每孔以100 µl接种至96孔板中，于5% CO₂、37℃培养箱孵育24 h。1%FBS血清饥饿2 h，设立阴性对照组和实验组，实验组每孔分别加入1 µl不同浓度的隐丹参酮（1、3、10、30及100 μmol/L），阳性对照组用5-Fu作相同处理，阴性对照组加入DMSO，每组设定8个复孔。在培养箱中培养24 h后，每孔加入15 µl 0.5%的MTT溶液，2 h后弃去上清液，每孔加入100 µl DMSO，振荡10 min，调节酶联免疫检测仪于490 nm波长处测量吸光度值，计算细胞存活率。重复3次独立实验，方法同上。细胞存活率=（实验组A₄₉₀-空白调零组A₄₉₀）/（对照组A₄₉₀-空白调零组A₄₉₀）。

1.2.3   食管癌HCE-4细胞形态学观察

收集处于对数生长期的食管癌HCE-4细胞，配制成细胞悬液，每孔1×10⁵个接种至6孔板。5%CO₂、37℃培养箱培养24 h后，以不同浓度的隐丹参酮（1、3、10、30及100 μmol/L）处理细胞，通过倒置显微镜观察HCE-4细胞的形态学变化，并进行分析。

1.2.4   Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡

收集处于对数生长期的HCE-4细胞，以每孔1×10⁵的密度接种至6孔板，5%CO₂、37℃培养箱中孵育24 h。用浓度为20 µmol/L的隐丹参酮处理细胞3、6、12和24 h，应用碧云天Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒，根据操作说明检测细胞凋亡情况，实验重复3次，并利用荧光显微镜照相，观察细胞凋亡情况。

1.2.5   流式细胞术检测细胞凋亡情况

收集处于对数生长期的HCE-4细胞，以每孔1×10⁵个密度接种至6孔板，于5%CO₂、37℃培养箱中孵育24 h。用浓度为20 µmol/L的隐丹参酮处理细胞3、6、12和24 h，收集细胞，弃去上清液后PBS洗涤1次。加入195 μl的Annexin V-FITC结合液重悬细胞，再加入3 μl Annexin V-FITC与2 μl PI，室温避光孵育15 min，每组加入300 μl PBS，转移至流式管，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.6   Western blot法检测细胞凋亡相关蛋白的表达量变化

收集处于对数生长期的HCE-4细胞，接种至3.5 cm培养皿中，20 µmol/L隐丹参酮处理3、6、12和24 h，收集细胞于1.5 ml离心管中。加入100 µl裂解液，冰上裂解30 min，12 000 r/min、4℃离心30 min，收集上清液，在595 nm处测得蛋白质浓度。取总蛋白30 µg用5×buffer上样，加热变性后使用12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，将蛋白质转至硝酸纤维膜上，脱脂乳封闭1 h，TBST洗涤5次，分别与ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38、AKT、p-AKT、Bad、Bcl-2、cleaved-caspase-3及cleaved-PARP结合，4℃摇床过夜孵育。TBST洗涤5次，以HRP标记山羊抗兔IgG、HRP标记山羊抗鼠IgG为二抗，室温孵育2 h，加入ECL化学发光试剂显色，利用AI600多功能成像仪成像，内参采用α-tubulin。

1.2.7   流式细胞术检测细胞内活性氧水平

收集处于对数生长期的HCE-4细胞，以每孔1×10⁵个密度接种至6孔板，于5%CO₂、37℃培养箱中孵育24 h。用浓度为20 µmol/L的隐丹参酮处理细胞3、6、12和24 h，收集细胞，弃去上清后PBS洗涤1次。加10 μmol/L的2, 7-二氯二氢荧光素二酯（2, 7-dichlorofluorescein diacetate, DCFH-DA），37℃恒温水浴锅中避光孵育30 min，PBS洗涤1次，500 μl PBS重悬细胞，转移至流式管后流式细胞仪检测细胞内活性氧水平。

1.2.8   活性氧清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）对隐丹参酮诱导HCE-4细胞凋亡的抑制作用

收集处于对数生长期的HCE-4细胞，以每孔1×10⁵个密度接种至6孔板，于5%CO₂、37℃培养箱中孵育24 h。以终浓度为5 mmol/L的活性氧清除剂NAC预处理30 min后，用20 μmol/L的隐丹参酮处理HCE-4细胞24 h。以PBS洗涤1次，加入195 μl Annexin V-FITC结合液重悬细胞，再加入3 μl Annexin V-FITC及2 μl PI，避光孵育15 min，300 μl PBS重悬，转移至流式管中通过流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.3   统计学方法

采用SPSS19.0软件进行统计分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2   结果

2.1   隐丹参酮对人食管癌HCE-4细胞的杀伤作用

MTT检测结果显示，随着隐丹参酮浓度的增加，食管癌HCE-4和TE-2细胞的存活率逐渐降低，表明隐丹参酮对HCE-4和TE-2细胞均具有良好的杀伤作用，并呈浓度依赖性。与阳性对照组（5-Fu）相比，差异有统计学意义，并且对人正常肝L-02和QSG-7701细胞无明显杀伤作用，见图 1。经计算，对食管癌细胞HCE-4和TE-2细胞的IC₅₀分别为16.5和23.89 µmol/L，HCE-4细胞对隐丹参酮的敏感度最高，因此后续实验以人食管癌HCE-4细胞作为主要研究对象。

图  1  不同浓度的5-Fu和隐丹参酮处理食管癌HCE-4、TE-2及正常肝L-02和QSG-7701细胞24 h后细胞的存活率

Figure  1  Viabilities of esophageal carcinoma HCE-4, TE-2 cells and normal liver L-02 and QSG-7701 cells treated with different concentration of 5-Fu and cryptotanshinone for 24h

***: P < 0.001, compared with control group(5-Fu); n=3; CT: cryptotanshinone

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2.2   人食管癌HCE-4细胞形态学观察

通过倒置显微镜对不同浓度（1、3、10、30及100 μmol/L）隐丹参酮处理后的HCE-4细胞进行形态学观察。未经药物处理的HCE-4细胞（0 μmol/L）生长状态良好，细胞呈多边型，单层生长，形态规则；而实验组细胞，随着隐丹参酮处理浓度的递增，细胞形态发生显著改变，出现细胞核固缩、变圆，颗粒感增强，悬浮细胞增多的现象，其中以处理浓度为100 μmol/L时细胞形态变化最为明显，见图 2。

图  2  不同浓度的隐丹参酮处理HCE-4细胞24 h后细胞的形态学观察(×200)

Figure  2  Morphological changes of HCE-4 cells treated with different concentration of cryptotanshinone for 24 h (×200)

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2.3   隐丹参酮对人食管癌HCE-4细胞的诱导凋亡作用

为了验证隐丹参酮是否能诱导HCE-4细胞凋亡，用终浓度为16.5 μmol/L的隐丹参酮处理HCE-4细胞3、6、12和24 h后，进行Annexin V-FITC/PI双染实验。结果显示，随着时间的增加，绿色荧光强度逐渐增强，即细胞凋亡程度逐渐增强。24 h时，HCE-4细胞的荧光强度最高，见图 3A，且显微镜下观察发现癌细胞基本均已凋亡。通过流式细胞术对细胞凋亡数量进行检测，发现随着时间的不断延长，细胞凋亡数量逐渐增加，24 h时，细胞凋亡水平最为明显，见图 3B。最后，通过Western blot法对凋亡相关蛋白的表达量变化进行检测，发现随着时间的延长，促凋亡蛋白Bad、caspase-3和PARP表达量升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表达量降低，见图 3C。以上结果表明，隐丹参酮能够诱导人食管癌HCE-4细胞凋亡，并呈时间依赖性。

图  3  隐丹参酮对HCE-4细胞的诱导凋亡作用

Figure  3  Apoptotic effects of cryptotanshinone on HCE-4 cells

*: P < 0.05, **: P < 0.01, ***: P < 0.001, compared with 0 h group; A: Annexin V-FITC/PI double staining (×200) and quantitative analysis; B: apoptotic rates detected by flow cytometry and quantitative analysis; C: expression levels of apoptosis-related proteins detected by Western blot and quantitative analysis

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2.4   隐丹参酮对上游相关蛋白表达量变化的影响

16.5 μmol/L的隐丹参酮处理HCE-4细胞3、6、12及24 h后，通过Western blot法检测上游相关蛋白的表达量变化。结果显示，随着时间的增加，促凋亡蛋白p-JNK和p-p38表达量增加，抗凋亡蛋白p-ERK和p-AKT表达量降低，表明隐丹参酮通过调控MAPK、AKT信号通路诱导HCE-4细胞凋亡，并呈时间依赖性，进而对HCE-4细胞发挥良好的杀伤作用，见图 4。

图  4  隐丹参酮对HCE-4细胞上游相关蛋白表达的影响

Figure  4  Effect of cryptotanshinone on expression levels of upstream-related proteins in HCE-4 cells

*: P < 0.05, **: P < 0.01, ***: P < 0.001, compared with 0h group; A-D: expression levels of upstream-related proteins determined by Western blot and quantitative analysis

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2.5   隐丹参酮增加人食管癌HCE-4细胞内ROS的水平

终浓度为16.5 μmol/L的隐丹参酮处理HCE-4细胞3、6、12和24 h后，通过DCFH-DA荧光探针法检测细胞内活性氧水平变化情况。结果显示，随着时间的增加，细胞内ROS水平明显升高，峰图向右侧移动，说明隐丹参酮可促进HCE-4细胞内ROS的产生，并呈时间依赖性，见图 5A。分别用隐丹参酮与NAC单独或共同处理HCE-4细胞24 h，结果发现隐丹参酮+NAC处理组与隐丹参酮单独处理组相比，细胞凋亡率明显降低，表明隐丹参酮通过上调细胞内ROS水平诱导HCE-4细胞凋亡，见图 5B。

图  5  隐丹参酮对HCE-4细胞内ROS水平的影响

Figure  5  Effect of cryptotanshinone on ROS levels in HCE-4 cells

*: P < 0.05, **: P < 0.01, ***: P < 0.001, compared with 0h group; MFI: mean of fluorescence index; A: intracellular ROS levels determined by flow cytometry and quantitative analysis; B: apoptotic effect of CT, NAC and CT+NAC on HCE-4 cells, and quantitative analysis

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3   讨论

肿瘤的发生是一个长期、多阶段、多基因参与的过程，而细胞凋亡在肿瘤发生和发展的过程中扮演着重要角色。有研究表明，细胞凋亡受到细胞因子和凋亡相关蛋白的协同调控，在多基因精确调控的凋亡受到抑制时会导致肿瘤的发生，因此诱导肿瘤细胞发生凋亡是一种治疗肿瘤的重要手段。在实验进行之前，通过查阅大量文献发现，隐丹参处理癌细胞浓度多为1~100 μmol/L^[12-14]，因此用浓度梯度为1、3、10、30及100 μmol/L的隐丹参酮处理细胞，以便找到隐丹参酮处理食管癌细胞的最适浓度。通过MTT实验检测隐丹参酮对人食管癌HCE-4细胞的杀伤效果，发现隐丹参酮对HCE-4细胞具有增殖抑制作用，呈剂量依赖性，且IC₅₀值为16.5 μmol/L，并通过Annexin V-FITC/PI双染和流式细胞术实验检测隐丹参酮对HCE-4细胞的诱导凋亡能力，在荧光显微镜下发现随着化合物处理时间的不断增加，细胞形态发生不规则变化并出现凋亡小体，细胞荧光强度逐渐增强，凋亡细胞数量逐渐增多，与倒置显微镜下所观察结果相似。

多年研究发现，线粒体凋亡途径诱导的细胞凋亡是被多种上游因子刺激后引发的，整个途径受到多种因素的调控，包括Bcl-2家族的pro、抗凋亡蛋白和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/AKT/mTOR途径^[15]。与正常细胞相比，Bcl-2家族成员中的抗凋亡蛋白发生失调是癌细胞的定义特征之一，它的存在会提高肿瘤细胞对当前所用治疗方式的抵抗^[16]，因此这些家族的成员已成为治疗众多癌症的靶标。AKT是调节细胞增殖、凋亡和迁移的重要信号分子，研究显示PI3K/AKT可以通过磷酸化Bad、释放抗凋亡蛋白Bcl-2以及激活caspase3/7等凋亡通路，进而调控细胞凋亡^[17-18]。同时也有研究显示，隐丹参酮可以通过激活下游的caspase-3信号通路抑制胆管癌HCCC-9810细胞的增殖^[19]。此外，MAPK是ras-MAPK信号通路的核心成分，MAPK激活后可以促进细胞核内c-Fos、c-Jun和c-Myc等转录因子的氨基酸残基发生磷酸化，从而调控基因的表达以促进细胞的生长、分化和凋亡^[20]。其中，P38和JNK可以通过上调cleaved-caspase-3和PARP的表达，诱导乳腺癌细胞凋亡^[21]；而ERK也可以通过磷酸化p53、AKT等蛋白诱导肿瘤细胞凋亡^[22-23]，表明MAPK信号通路在肿瘤的发生发展过程中扮演着重要的角色。为了验证隐丹参酮是否通过调控以上通路诱导食管癌HCE-4细胞凋亡，利用Western blot实验对上游相关蛋白表达情况进行检测，发现隐丹参酮可以上调p-JNK、p-p38、caspase-3和PARP蛋白的表达，下调p-ERK、p-AKT和Bcl-2蛋白的表达。以上结果表明，隐丹参酮可以通过调控MAPK和AKT信号通路诱导人食管癌HCE-4细胞凋亡。

研究显示，活性氧（ROS）是人体内代谢的正常产物，在细胞信号和体内平衡过程中发挥重要的作用^[24]。当细胞内ROS水平升高时，线粒体的通透性发生改变，基质肿胀，外膜破裂，导致细胞凋亡信号分子释放。此外，ROS还具有调节信号分子活性的作用，如NF-κB、AP-1和MAPK等信号通路，进而表现出调控细胞生长、分化、凋亡和侵袭等生物学效应^[25]。本实验通过流式细胞术检测细胞内活性氧水平，发现随着隐丹参酮处理时间的不断增加，HCE-4细胞内ROS水平不断升高。同时，隐丹参酮与NAC共同处理细胞后，细胞凋亡程度明显低于隐丹参酮单独处理组，隐丹参酮的诱导凋亡能力被抑制，这表明隐丹参酮可以通过上调细胞内ROS的水平，诱导人食管癌HCE-4细胞凋亡。

综上所述，隐丹参酮对人食管癌HCE-4细胞具有良好的杀伤作用，其分子机制可能是隐丹参酮通过增加细胞内活性氧水平，调控MAPK和AKT信号通路，进而诱导HCE-4细胞凋亡，这为食管癌以及其他癌症的治疗与新药开发提供了新思路。