0   引言

头颈癌是全世界第六大常见肿瘤类型，其中喉癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，而喉鳞状细胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC）是喉癌中最常见的组织学类型（约85%~90%）^[1]。随着医学的发展，喉癌的治疗方式也越来越多，但喉癌的死亡率并没有明显改善^[2]，其主要原因是目前缺乏简单适用的筛查方法。

微小RNA（microRNA, miRNA）是指长度约22个核苷酸的内源性微小非编码RNA，是多种生物学过程的有效调节子^[3]。对miRNA的研究表明：miRNA参与了人体细胞内多种重要的调节过程^[4]。其中miRNAs与肿瘤发生、发展的关系已成为目前研究的热点。近年来，有关miRNA在LSCC诊断及转移等方面的研究层出不穷，已有多项研究发现LSCC患者的组织和血液（包括血清和血浆）中有特别的miRNA表达谱^[5-7]，并能提示LSCC的诊断。而对于miRNA在LSCC患者唾液中的表达水平以及其对早期LSCC的诊断价值如何，国内外至今未见研究报道。唾液作为血液循环的末端产物，与血液中的很多物质都有相同的表达谱，目前，已发现唾液上清液（无细胞）中含有上千种分子物质，包括蛋白质、mRNA、miRNA、代谢产物等^[8-11]。相比于组织标本，唾液的非侵入性更适合早期筛查。相比于血液标本，由于头颈部鳞状细胞癌大多数是涉及口腔及咽喉部的病变，唾液作为最邻近病变组织的标本来源，其miRNA的含量可能比血液高，因此唾液中的miRNA作为生物标志物对LSCC的诊断和预后判断是非常吸引人的。所以目前唾液miRNA在头颈部鳞癌中的研究仍是热点，其中口咽癌、食管癌等^[12-13]都有单独的研究并发现有特征的唾液miRNA变化谱，而单独的LSCC患者唾液中miRNA的表达水平还未见报道过。

miRNA-21作为miRNAs家族中的一员，在许多肿瘤中扮演着重要的角色，包括乳腺癌、肝癌、食管癌、喉癌等^{[5, 13-15]}，其在LSCC患者唾液中的表达在国内外还缺乏前瞻性的研究。此次研究我们将探讨LSCC患者唾液中miRNA-21对LSCC早期诊断的临床价值。

1   资料与方法

1.1   研究对象与分组

研究对象为西南医科大学附属医院就诊并收治的20例喉鳞状细胞癌患者、15例喉声带息肉（vocal cord polyp, VCP）患者以及体检中心的健康体检者。所有LSCC、VCP患者入院后均经病理活检证实，并且无伴发其他慢性病、传染性疾病、口腔疾病等，如糖尿病、结核、或口腔溃疡等，LSCC患者均为初诊患者，手术前未接受放化疗等治疗。以年龄、性别、无其他疾病的VCP患者、健康体检者作为对照组。所有纳入的研究个体均签署了知情同意书。

同时收集整理LSCC患者的临床资料，包括性别、年龄、个人史（吸烟、饮酒史）、肿瘤生长部位（分为声门、声门下、声门上）、分化程度（低、中、高）、临床病理分期。肿瘤临床分期根据肿瘤的生长范围及扩散程度，按2002年国际抗癌联盟（UICC）喉癌TNM分类分期方案分为Ⅰ~Ⅳ期。

1.2   唾液收集

唾液收集前，所有研究个体需禁食、禁饮2 h以上。收集时使用50 ml无菌无酶离心管，采用非刺激性的收集方法使唾液自然流出，收集量需达3 ml。唾液在30 min内收集完。为了去除细胞碎片及一些不溶成分，唾液收集完后，4℃、1 900 g离心10 min取上层上清液至1.5 ml EP管，再以4℃、16 000 g离心10 min后再弃沉淀取上清液，将所获上清液以每管250 μl分装后置-80℃保存。标本收集好后需2 h之内作出上述处理。LSCC患者手术前和手术后6月各采集一次唾液标本；VCP患者术前采集一次唾液标本；健康体检者采集一次唾液标本。

1.3   总RNA提取及cDNA合成

提取试剂选择德国Qiagen公司的血清/血浆miRNA提取试剂（miRNeasy Serum/Plasma）试剂盒（规格型号：217184）。按照试剂盒说明书，取解冻后的唾液上清液200 μl，加入1 000 μl裂解液（QIAzol Lysis Reagent），剧烈震荡后室温下（15℃~25℃）放置5 min；加入3.5 μl Qiagen公司的血清/血浆纯化试剂盒外参（miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control）（cel-39）（规格型号：219610）作为外参，混匀，再加200 μl氯仿，剧烈摇动15 s，室温保存2~3 min；4℃、12 000 g离心15 min；吸上层无色水相，移入另一EP管中（约400 μl）；加入1.5倍体积的无水乙醇，混匀；吸700 μl样品到抽提微量RNA（RNeasy MinElute）离心柱中；10 000 g，室温离心15 s，弃去收集管中的液体；分别用700 μl缓冲液RWT、缓冲液RPE、80%乙醇洗脱后，总RNA结合到膜上，苯酚和其他污染物被有效洗去；最后加入14 μl无酶水将离心柱上的RNA洗脱下来。使用分光光度计（NanoDrop ND-1000）检测评价所提取总RNA的质量，总RNA的OD260/OD280值在1.8~2.1之间为合格的RNA样品，说明样品RNA制备较纯，无蛋白质污染，样品可进行下一步操作。

取12 μl提取的合格的RNA以Qiagen公司的miRNA反转录（miScript Ⅱ RT试剂盒）（规格型号：218161）进行反转录，该试剂采用poly（A）聚合酶多腺苷酰化成熟miRNA，并利用反转录酶及oligo-dT引物扩增将其转变为cDNA。按照试剂盒说明操作如下：加入2 μl miRNA反转录混合物（miScript Reverse Transcriptase Mix）（一种经优化的poly（A）聚合酶和反转录酶混合物）、2 μl miRNA反转录核酸混合物（10×miScript Nucleics Mix）（包括dNTPs、rATP、oligo-dT引物等）、4 μl缓冲液（5×miScript HiSpec Buffer），然后进行反转录，反应体积为20 μl，反应条件为37℃ 60 min，95℃ 5 min。反转录中加样过程置于冰上操作。反转录反应完成后cDNA用无酶水以1:10稀释后置-20℃保存。

1.4   RT-PCR检测miRNA-21

以Qiagen公司miRNA定量（miScript SYBR Green PCR）试剂盒（规格型号：218073），按照25 μl反应体系进行RT-PCR检测。检测体系包括：2.5 μl稀释后的cDNA、2.5 μl特异前向引物（miRNA-21的引物由上海生工生物工程有限公司合成F：5' -AGCGTAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3’；外参引物包含在Qiagen公司的提取试剂血清/血浆miRNA提取试剂（miRNeasy Serum/Plasma）试剂盒中、2.5 μl 10×miScript Universal Primer（通用的反向引物）、12.5 μl miRNA定量混合物（2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix）、5 μl无酶水。RT-PCR条件为：95℃ 15 min后，94℃ 15 s，55℃ 30 s，70℃ 30 s，40个循环。同时做溶解曲线是判断基因扩增的特异性。扩增采用ABI 7500仪器进行。所有样品做3复孔，对测量的Ct值取平均值，排除掉Ct值大于35的数据。根据待测标本的Ct值，以Cel-miRNA-39作为外参，用2^-ΔΔCt法对目的基因进行相对定量^[16]。最后，扩增结束后将扩增产物置于1%的琼脂糖凝胶中以110 V电压电泳30 min，GBOX-CHemi-XR5凝胶成像系统做电泳结果分析。

1.5   统计学方法

采用SPSS20.0统计软件进行处理，三组之间的年龄差异使用单因素方差分析检验。采用Shapiro-Wilk检验来验证数据的正态性，发现所有数据都不满足正态分布。因此采用Mann Whitney U检验来比较不同组间miRNA-21表达水平的差异。miRNA的相对表达水平以（x±s）表示。miRNA-21在LSCC中的诊断效能采用ROC曲线来分析。图像绘制采用GraphPad Prism5.0进行图像绘制。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2   结果

2.1   研究对象的基本特征

纳入的研究者均为男性，汉族。LSCC患者组平均年龄为59.65±8.97，VCP患者组平均年龄为53.13±8.58，健康体检者组平均年龄为54.33±7.93。采用单因素方差分析发现，三组之间的年龄均值差异无统计学意义（F=2.944，P=0.062）。

2.2   RT-PCR法扩增结果

所有样本均可检出外参Cel-miRNA-39及miRNA-21，两种产物熔解曲线均为单峰，Tm值分别为76.0℃与75.6℃，扩增曲线均呈“S”形。产物琼脂糖凝胶电泳条带位于约80~100 bp，见图 1。说明该研究中外参Cel-miRNA-39及miRNA-21扩增的特异性良好，无非特异性扩增，符合本次实验的要求。

图  1  RT-PCR法扩增结果

A: the dissociation curve of Cel-miRNA-39; B: the dissociation curve of miRNA-21; C: amplification curve; D: electrophoresis results of RT-PCR products

Figure  1  Amplification results of RT-PCR method

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2.3   各组患者唾液中miRNA-21的相对表达水平

采用RT-PCR定量检测20例LSCC患者和15例健康者唾液中的miRNA-21表达水平，发现与健康对照组（1.56±0.36）相比，LSCC患者的唾液中miRNA-21的表达水平（5.13±1.08）显著上调，差异有统计学意义（P=0.036）。15例VCP患者唾液中的miRNA-21的表达水平（2.42±0.84）相比于健康对照组也呈上调趋势，但差异无统计学意义（P=1.000），而比较LSCC患者和VCP患者唾液中miRNA-21的表达水平发现，VCP患者唾液中miRNA-21表达水平更低，但差异无统计学意义（P=0.086），见图 2。

图  2  三组唾液中miRNA-21的相对表达水平

Figure  2  Relative expression of miRNA-21 in saliva of the three groups

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2.4   LSCC患者唾液中miRNA-21的相对表达水平与临床参数的相关性

采用Mann Whitney U检验统计分析发现，肿瘤中分化者（7.13±2.69）较肿瘤高分化者（4.47±1.14）唾液中miRNA-21的相对表达量高，Ⅲ~Ⅳ期的LSCC患者唾液中miRNA-21的相对表达量（5.64±2.17）也高于Ⅰ~Ⅱ期的患者（5.04±1.23），但均未达到统计学意义（P=0.349, 0.616）。其他临床参数（包括患者年龄、吸烟、饮酒史、肿瘤的生长部位）与miRNA-21的表达水平均无明显相关性，见表 1。

表  1  LSCC患者唾液中miRNA-21的相对表达水平与临床参数的相关性

Table  1  Correlation of relative expression of miRNA-21 in saliva with clinical parameters of LSCC patients

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2.5   LSCC患者唾液中miRNA-21对LSCC的诊断价值

采用ROC曲线分析miRNA-21对LSCC的诊断价值发现，唾液中miRNA-21区分LSCC患者与健康者的曲线下面积为0.792（95%CI: 0.5353~0.885, P=0.036），截断值取1.223时，敏感度与特异性分别为75%与60%，见图 3。说明唾液中的miRNA-21检测可能可以作为LSCC诊断的生物标志物。

图  3  ROC曲线分析miRNA-21对LSCC的诊断价值

Figure  3  Prognostic value of miRNA-21 for LSCC analyzed by ROC curve

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2.6   LSCC患者唾液中miRNA-21术前术后的变化

为了评价LSCC患者唾液中miRNA-21术前术后的动态变化，监测了6名LSCC患者手术前和手术后6月的miRNA-21变化，手术后miRNA-21相对表达水平（0.48±0.31）较手术前（5.35±2.45）明显下降，差异有统计学意义（P=0.041），见图 4。比较了手术后与健康对照组miRNA-21的表达量发现，手术切除肿瘤组织后，miRNA-21的水平显著下降，与健康对照组的miRNA-21表达量相比差异无统计学意义（P=0.800）。

图  4  LSCC患者手术前与手术后唾液中miRNA-21相对表达水平的关系

Figure  4  Relative expression of miRNA-21 in saliva of LSCC patients before and after operation

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3   讨论

目前已有很多研究发现miRNAs在肿瘤组织中的差异表达可用于肿瘤的诊断，但肿瘤组织的收集是侵入性、有创性的操作，且肿瘤组织的出现说明患者已出现了癌变，不适用于广泛人群的早期大规模普遍筛查。

LSCC作为头颈部肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一，找到一个无创、方便且能够快速、早期诊断的方法显得尤为重要。唾液是一种非侵入性的、方便的、易获取的标本来源，唾液诊断的应用将开启无创诊断的大门，因此以唾液作为标本筛查疾病是非常吸引人的。近年来已有许多研究发现唾液中的一些分子物质可用于疾病的诊断，包括癌症、自身免疫性疾病和心血管疾病等^[8-11]。如Zhang等^[17]研究发现唾液中4种mRNA（KRAS、MBD3L2、ACRV1和DPM1）组合检测可以区分胰腺癌与非肿瘤患者（慢性胰腺炎和正常对照）；Gursoy等^[18]发现唾液中IL-1β与多个牙周致病菌的存在，可提示牙周炎的诊断；HIV也可通过检测口腔黏膜渗出液（OMT）中的HIV-1/2抗体来实现快速诊断，早在2002年，美国食品药品管理局就已批准了第一个应用OMT替代血液检测人类免疫缺陷病毒（HIV）的快速检测试剂^[19-20]。随着高通量微阵列芯片检测技术和Real-time RT-PCR技术的广泛应用，唾液miRNA在各种肿瘤中的研究也逐渐增多。

目前，已有多项研究发现唾液miRNA可用于头颈部鳞癌中的诊断，如Salazar等^[21]首先证明头颈部鳞状细胞癌患者唾液标本中miR-9、miR-191和miR-222的高表达，并且证实了从少量的唾液标本（200 μl）中就能够提取出足够的miRNA用于研究。Park等^[12]检测了口腔癌患者的全唾液和经过离心后收集的唾液上清内的miRNA，发现miR-125a和miR-200a相比于健康对照组显著下调，说明其有望成为口腔癌的早期无创性诊断标志物。同时他们也发现唾液miRNA的表达非常稳定，不会轻易降解，其表达量可以长时间恒定表达。叶敏华等^[22]研究发现检测miRNA-21在唾液中的表达诊断食管癌有望代替血浆检测。此外，还有研究发现^[23]，唾液中miRNA的表达量在同一机体内不会随时间的推移而改变，即唾液miRNA表达量恒定。这些研究都提示唾液miRNA的检测可能可以代替血液检测，开启疾病早期诊断的无创时代。

目前国内外有关miRNA在LSCC诊断及转移等方面的研究越来越多，但样本类型都局限于组织和血液（包括血清和血浆）中，其中miRNA-21已发现在喉癌组织及血液中都呈高表达^{[5, 24]}，目前认为miRNA主要通过与3’非编码区互补配对，并根据互补的差异性指导沉默复合体对同期的靶向mRNA进行切割或者翻译抑制，近来的研究发现，miRNA-21参与调节多种抑癌基因的表达^[25]，包括PTEN基因、TPM1基因等，因此其可能作为一种致癌因子促进LSCC的发生发展。在本研究中，我们发现LSCC患者的唾液中miRNA-21的表达水平相比于健康者显著上调，而与LSCC早期症状相似的VCP患者也呈上调趋势，但差异无统计学意义。VCP患者唾液中miRNA-21的表达水平与健康者虽然也有上调但差异无统计学意义。这说明检测唾液中miRNA-21的表达水平可用于区分LSCC与健康者，但其是否可用于区分LSCC与VCP还需更多的样本进一步验证。我们同时比较了6名LSCC患者手术前和手术后唾液中miRNA-21的动态变化，发现LSCC患者手术后唾液miRNA-21的水平显著下降，基本达到了健康组的水平。唾液中miRNA-21的这种变化趋势与之前肿瘤组织和血液研究中的miRNA-21变化一致，说明了其可能与血液相似，都是来源于肿瘤组织细胞的释放，这也与目前许多研究者认为的循环中核酸起源的假设一致^[26]，但其真正的来源与机制还需要进一步的研究探索。

本研究显示了唾液中的miRNA-21检测将来有望可作为LSCC诊断的生物标志物且诊断性能良好。同时我们分析了一些基本临床参数与miRNA-21表达水平的关系，虽然结果显示肿瘤中分化者较肿瘤高分化者唾液中miRNA-21的相对表达量高，Ⅲ~Ⅳ期的LSCC患者唾液中miRNA-21的相对表达量也高于Ⅰ~Ⅱ期的患者，但差异均无统计学意义（P=0.349, 0.616）。这可能与我们所纳入的研究样本较少、组间差异大有关，这其中的相关性尚需进一步研究。

综上所述，本次研究首次检测了LSCC患者唾液中miRNA-21的表达水平并发现唾液miRNA-21将来有望可能作为LSCC早期诊断的标志物。这对miRNA走向临床应用具有重大意义。本次研究由于是初步的探讨性研究，样本数量较少，需进一步扩大样本，进行更深入的研究。