Napsin A, TTF1 and SPA Protein Expressions and Their Correlation with EGFR Gene Mutations in Primary Lung Adenocarcinoma
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摘要:目的
探讨Napsin A、TTF1、SPA在原发性肺腺癌中的表达及与EGFR基因突变的相关性。
方法免疫组织化学法检测306例原发性肺腺癌组织中Napsin A、TTF1、SPA蛋白的表达。ARMS法同时检测这些组织中EGFR基因是否突变。
结果Napsin A在原发性肺腺癌中表达率为87.25%，TTF1在原发性肺腺癌中表达率为80.72%，SPA在原发性肺腺癌中表达率为60.46%。EGFR基因在原发性肺腺癌中的突变率为40.20%。TTF1、Napsin A、SPA蛋白表达阳性患者EGFR基因突变率均较表达阴性患者高，差异均有统计学意义（P < 0.01）。
结论我们可以通过检测Napsin A、TTF1和SPA是否表达来简单预测原发性肺腺癌中EGFR基因是否会有突变，这对于一些组织不够用于开展分子检测的患者或不能开展分子检测的医院十分实用。
Abstract:ObjectiveTo observe Napsin A, TTF1 and SPA protein expressions and their correlation with EGFR gene mutation in primary lung adenocarcinoma tissues.
MethodsImmunohistochemistrical method was used to detect Napsin A, TTF1 and SPA protein expressions in 306 cases of primary lung adenocarcinoma tissues, while ARMS method was used to detect whether there was EGFR gene mutation in these tissues.
ResultsNapsin A, TTF1 and SPA expression rates were 87.25%, 80.72% and 60.46% in primary lung adenocarcinoma. EGFR gene mutation rate was 40.20% in primary lung adenocarcinoma. Patients with positive TTF1, Napsin A, SPA expressions had higher EGFR gene mutation rate than those with negative expressions (P < 0.01).
ConclusionWe can simply predict whether EGFR gene mutation in primary lung adenocarcinoma will occur by detecting whether Napsin A, TTF1 and SPA protein are expressed, and this is very practical for a patient whose tissues are not enough for molecular detection or a hospital where molecular detection cannot be carried out.
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Key words:
- Immunohistochemical marker /
- Napsin A /
- TTF1 /
- SPA /
- EGFR gene /
- Primary lung adenocarcinoma
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0 引言
目前临床上在肺原发性腺癌患者中应用最广且疗效最显著的分子靶向治疗药物是针对EGFR基因突变的靶向治疗药物如吉非替尼、厄洛替尼等[1-3]。EGFR基因突变的检测方法很多，但这些方法对组织标本、实验设备、质量控制、费用等要求高，耗时较长，使部分患者失去了检测机会，延误治疗。天门冬氨酸蛋白酶Napsin A，甲状腺转录因子1（thyroid transcription factor, TTF1）及表面活性物质相关蛋白A（pulmonary surfactant-associated protein A, SPA）在原发性肺腺癌中表达的特异性及敏感度均极高，可用于鉴别原发性肺腺癌与转移性肺肿瘤[4-6]，且其检测方法为免疫组织化学染色法。这种方法比较成熟，且快捷方便，染色结果比较稳定，费用较便宜，目前国内大部分医院均已开展。
本研究旨在探讨肺腺癌中Napsin A、TTF1及SPA蛋白表达与原发性肺腺癌患者临床病理特征之间的关系，并进一步分析它们与EGFR基因突变的相关性，以期通过这些免疫组织化学指标来达到预测EGFR基因突变的目的，以便指导患者进行靶向治疗，为靶向治疗提供参考指标，避免盲目用药。
1 资料与方法
1.1 资料
收集无锡市第四人民医院病理科2007年1月—2015年7月经活检及手术切除并进行过EGFR基因检测的原发性肺腺癌组织标本306例。患者术前均未行化疗、放疗。所有标本均经HE染色后病理证实。306例腺癌中，高分化39例、中分化178例、低分化89例；其中男169例、女137例，年龄31~85岁，中位年龄59岁，≥59岁者216例， < 59岁者90例。
1.2 方法
所有标本均经10%的中性福尔马林固定，常规脱水后经石蜡包埋，连续切片数张，用于常规病理确诊及免疫组织化学染色，每张切片厚度均为4 μm。采用免疫组织化学EnVision二步法进行免疫组织化学染色，DAB显色，染色步骤严格按照试剂盒说明书进行。所使用免疫组织化学TTF1、Napsin A、SPA单克隆抗体及EnVision二步法试剂盒均购自上海基因科技有限公司，分别用PBS代替一抗作为空白对照，阳性切片作为阳性对照。用荧光PCR法进行EGFR基因突变检测，所使用试剂盒购自厦门艾德公司，石蜡固定标本DNA提取试剂盒购自德国QIAGEN公司，主要针对19, 21外显子进行检测。
1.3 结果判断
Napsin A、SPA免疫组织化学染色定位于细胞质，TTF1定位于细胞核。染色阳性信号呈棕黄色。400倍高倍镜下观察至少5个视野，取平均值。根据阳性细胞数量及显色强弱分为：无细胞染色为阴性（-），阳性细胞所占比例 < 10%为阳性（+），阳性细胞数占10%~50%为阳性（++），阳性细胞数 > 50%为强阳性（+++）。为便于统计描述，对样本进行分类，0到（+）为弱染，定为阴性，（++）到（+++）为强染，定为阳性表达。
1.4 统计学方法
所有数据均用SPSS12.0统计软件，采用χ2检验，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 TTF1、Napsin A及SPA与原发性肺腺癌患者临床病理特征的关系
TTF1、Napsin A及SPA在原发性肺腺癌中的表达与年龄无相关性（P=0.8370、0.35、0.0515），女性患者较男性患者阳性率高（P=0.0061、0.0003、0.002），不吸烟患者较吸烟患者阳性率高（P=0.0000、0.001、0.0000），无淋巴结转移患者较有淋巴结转移患者阳性率高（P=0.0011、0.0305、0.0096），另外随着分化程度降低，其阳性率降低，差异均有统计学意义（P=0.0001、0.0000、0.0000），见表 1。
表 1 TTF1、Napsin A及SPA与原发性肺腺癌患者临床病理特征的关系Table 1 Relationship of TTF1's, Napsin A's and SPA's expressions with clinicopathological features of primary lung adenocarcinoma patients
2.2 EGFR突变与原发性肺腺癌患者临床病理特征的关系
306例肺腺癌患者中EGFR突变者123例（40.2%），为19和21外显子突变。EGFR基因突变率女性患者较男性患者高（P=0.0362），不吸烟者患者较吸烟患者高（P=0.0014），随着分化程度降低，其突变率增高，差异有统计学意义（P=0.0000）。EGFR基因突变与患者年龄、有无淋巴结转移无相关性，见表 2。
表 2 EGFR基因突变与原发性肺腺癌患者临床病理特征的关系Table 2 Relationship between EGFR mutation and clinicopathological features of primary lung adenocarcinoma patients
2.3 TTF1、Napsin A、SPA蛋白表达与EGFR基因突变的相关性
TTF1阳性患者EGFR基因突变112例，突变率为45.34%，TTF1阴性患者，EGFR基因突变11例，突变率为18.64%；Napsin A阳性患者，EGFR基因突变117例，突变率为43.82%，Napsin A阴性患者，EGFR基因突变6例，突变率为15.38%；SPA蛋白阳性患者，EGFR基因突变98例，突变率为52.97%，SPA蛋白阴性患者，EGFR基因突变25例，突变率为20.66%。TTF1、Napsin A及SPA蛋白表达阳性患者EGFR基因突变率均较表达阴性患者高，差异有统计学意义（P=0.0002, 0.0007, 0.0000），见表 3。
表 3 TTF1、Napsin A、SPA蛋白表达与EGFR基因突变的相关性Table 3 Correlation of Napsin A, TTF1 and SPA protein expressions with EGFR gene mutation
3 讨论
原发性肺腺癌是一类侵袭性强、预后差的恶性肿瘤，其恶性程度较鳞癌高，进展较鳞癌快，且发病率越来越高，一直以来是研究的焦点。甲状腺转录因子1（thyroid transcription factor, TTF1）属NKx2转录因子，常表达于胚胎时期的肺、甲状腺、前脑的上皮和成人时期的肺、甲状腺。在正常肺组织中，TTF-1主要表达于终末呼吸单位，包括呼吸性细支气管、肺泡管、肺泡囊、肺泡[6]。Napsin A是新的天门冬氨酸蛋白酶，在肺和肾脏显著表达。大量研究表明Napsin A蛋白在原发性肺腺癌中的表达特异性极高，因而可以鉴别原发性肺腺癌与转移性肺肿瘤[4-6]。SPA是肺表面活性蛋白的重要组成部分，主要由Ⅱ型肺泡上皮和Clara细胞分泌，对于维持肺泡正常形态及功能都有重要作用，也是目前常用的Ⅱ型肺泡上皮和肺腺癌肿瘤标志物之一[7]。文献报道SPA在肺腺癌中的表达约50%左右[7-8]。
TTF-1、Napsin A、SPA蛋白在肺肿瘤特别是肺腺癌中的表达均具有高敏感度和高特异性的特点，是一直以来在肺肿瘤起源及肺原发性腺癌诊断及鉴别诊断中经常使用并且效果较好的一组免疫组织化学抗体[9-10]。本研究中我们发现在原发性肺腺癌中三者的表达均为女性患者较男性患者阳性率高，不吸烟患者较吸烟患者阳性率高，无淋巴结转移患者较有淋巴结转移患者阳性率高，另外随着分化程度降低，其阳性率降低，差异均有统计学意义（P < 0.05）。既往有很多研究表明TTF-1、Napsin A也是判断原发性肺腺癌预后的较好的独立指标[10-11]。
EGFR基因突变检测在肺腺癌中具有重要作用，是晚期肺腺癌患者一线使用靶向治疗药物如吉非替尼、厄洛替尼等的先决条件。EGFR基因突变在原发性肺腺癌、女性、不吸烟及东亚人中更为常见[12-13]，本研究中其突变率也是女性患者较男性患者高，不吸烟患者较吸烟患者高，我们还发现原发性肺腺癌中分化程度降低EGFR基因突变率越高。EGFR基因突变检测的方法很多，各有优缺点。我院目前使用的方法为ARMS法，其核心技术为荧光PCR，是目前较为敏感的检测方法，该方法能检测出肺活检标本中较少的癌细胞中的EGFR基因突变。
既往研究表明肺癌中TTF1蛋白表达与EGFR基因突变有关，TTF1蛋白表达阴性的患者，往往其EGFR基因无突变[14]。本研究中也发现TTF1蛋白阳性的肺腺癌患者中EGFR基因突变率较TTF1蛋白阴性的患者高，差异有统计学意义。Napsin A蛋白表达阳性的肺腺癌患者其临床病理特征与TTF1蛋白表达阳性患者相似，它也是一个较好的判断肺腺癌患者预后的指标[15]。同样我们也发现Napsin A, SPA蛋白表达阳性患者EGFR基因突变率高，差异有统计学意义。
TTF-1、Napsin A及SPA蛋白表达只需用免疫组织化学法就可以进行检测。免疫组织化学是一种快速、经济、简便的方法，在一般的实验室就可以进行，目前我国绝大部分医院都已经开展，是日常工作当中必不可少的一种实验室检测方法。而EGFR基因突变检测对客观条件要求较高，检测费用较贵，目前一般只有一些大医院可进行EGFR基因检测，国内很多中小型医院不能检测EGFR基因突变。另外临床上需要分子靶向治疗的肺癌患者往往已经是晚期患者，常常不能手术切除只能通过活检来获取一些小组织，对于分化较差的肿瘤，这些组织仅能用于免疫组织化学分型，没有足够的组织能够用于分子检测。本研究通过分析TTF-1、Napsin A、SPA蛋白表达与EGFR基因突变之间的相关性，提示临床医生在患者实在无法行EGFR基因突变检测时可以通过检测TTF-1、Napsin A、SPA蛋白表达来对EGFR基因突变状态进行简单的预测，也可以用来判断肺腺癌患者的预后。
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表 1 TTF1、Napsin A及SPA与原发性肺腺癌患者临床病理特征的关系
Table 1 Relationship of TTF1's, Napsin A's and SPA's expressions with clinicopathological features of primary lung adenocarcinoma patients
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表 2 EGFR基因突变与原发性肺腺癌患者临床病理特征的关系
Table 2 Relationship between EGFR mutation and clinicopathological features of primary lung adenocarcinoma patients
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表 3 TTF1、Napsin A、SPA蛋白表达与EGFR基因突变的相关性
Table 3 Correlation of Napsin A, TTF1 and SPA protein expressions with EGFR gene mutation
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