高级搜索

醌茜素对人肝癌Huh7细胞的凋亡诱导作用及其抗肿瘤机制

刘畅, 徐宛婷, 朴仙姬, 罗英花, 孟令旗, 王玥, 王浩, 王加茹, 张翼, 孙虎男, 金成浩

刘畅, 徐宛婷, 朴仙姬, 罗英花, 孟令旗, 王玥, 王浩, 王加茹, 张翼, 孙虎男, 金成浩. 醌茜素对人肝癌Huh7细胞的凋亡诱导作用及其抗肿瘤机制[J]. 肿瘤防治研究, 2017, 44(7): 454-459. DOI: 10.3971/j.issn.1000-8578.2017.16.1523
引用本文: 刘畅, 徐宛婷, 朴仙姬, 罗英花, 孟令旗, 王玥, 王浩, 王加茹, 张翼, 孙虎男, 金成浩. 醌茜素对人肝癌Huh7细胞的凋亡诱导作用及其抗肿瘤机制[J]. 肿瘤防治研究, 2017, 44(7): 454-459. DOI: 10.3971/j.issn.1000-8578.2017.16.1523
LIU Chang, XU Wanting, PIAO Xianji, LUO Yinghua, MENG Lingqi, WANG Yue, WANG Hao, WANG Jiaru, ZHANG Yi, SUN Hu'nan, JIN Chenghao. Apoptotic Effect of Quinalizarin on Human Hepatoma Huh7 Cells and Its Antitumor Mechanism[J]. Cancer Research on Prevention and Treatment, 2017, 44(7): 454-459. DOI: 10.3971/j.issn.1000-8578.2017.16.1523
Citation: LIU Chang, XU Wanting, PIAO Xianji, LUO Yinghua, MENG Lingqi, WANG Yue, WANG Hao, WANG Jiaru, ZHANG Yi, SUN Hu'nan, JIN Chenghao. Apoptotic Effect of Quinalizarin on Human Hepatoma Huh7 Cells and Its Antitumor Mechanism[J]. Cancer Research on Prevention and Treatment, 2017, 44(7): 454-459. DOI: 10.3971/j.issn.1000-8578.2017.16.1523

醌茜素对人肝癌Huh7细胞的凋亡诱导作用及其抗肿瘤机制

基金项目: 

黑龙江省自然科学基金 LC2015036

黑龙江省大学生创新创业训练计划项目 201710223001

黑龙江八一农垦大学校内培育课题 XA2015-04

黑龙江八一农垦大学研究生创新科研项目 YJSCX2017-Y72

详细信息
    作者简介:

    刘畅(1993-),女,硕士在读,主要从事抗肿瘤药物药理学方面的研究

    通讯作者:

    金成浩,E-mail: jinchenghao3727@qq.com

  • 中图分类号: Q78;R735.7

Apoptotic Effect of Quinalizarin on Human Hepatoma Huh7 Cells and Its Antitumor Mechanism

More Information
  • 摘要:
    目的 

    探讨醌茜素诱导人肝癌Huh7细胞凋亡的机制。

    方法 

    MTT法测定醌茜素对人肝癌HepG2、Hep3B和Huh7细胞的杀伤作用;倒置显微镜下观察醌茜素处理后Huh7细胞形态学变化;Annexin V-FITC/PI双染法及流式细胞术检测其对肝癌Huh7细胞的诱导凋亡作用;蛋白质免疫印迹法检测细胞凋亡相关蛋白的表达量变化;流式细胞术检测醌茜素处理后细胞内ROS的表达水平。

    结果 

    与对照组(0 h)相比醌茜素能够明显抑制人肝癌细胞的存活率(P=0.0204)。经醌茜素处理后的实验组Huh7细胞呈现经典的细胞皱缩、核固缩等现象。实验组(24 h)Huh7细胞凋亡率为50.63%,明显高于对照组(0 h)(15.58%)(P=0.0001)。共同处理Akt抑制剂和醌茜素后,促凋亡蛋白Bad和cleaved-caspase-3表达量均逐渐增加,抗凋亡蛋白磷酸化的Akt和Bcl-2均逐渐减少(P < 0.05)。醌茜素处理后,可增加Huh7细胞内活性氧的水平。

    结论 

    醌茜素对人肝癌Huh7细胞具有杀伤作用,且呈浓度依赖性。其机制可能是醌茜素抑制细胞内Akt的表达及磷酸化水平或诱导活性氧的产生,进而促进Huh7细胞的凋亡。

     

    Abstract:
    Objective 

    To investigate the effect of quinalizarin on the apoptosis of hepatoma Huh7 cells and to explore its possible mechanism.

    Methods 

    Human hepatoma HepG2, Hep3B and Huh7 cells viabilities were detected by MTT assay. The morphological alterations of Huh7 cells were demonstrated by inverted microscope. Cell apoptosis was analyzed by Annexin V-FITC/PI double staining and flow cytometry. The expressions of apoptotic proteins were detected by Western blot. The levels of ROS were measured by flow cytometry after quinalizarin treatment.

    Results 

    MTT assay results suggested that compared with control group (0 h), quinalizarin significantly inhibited the viabilities of human hepatoma HepG2, Hep3B and Huh7 cells in a dose-dependent manner (P=0.0204). The apoptotic morphology of Huh7 cells in the experimental group was found under the inverted microscope, such as cell shrinkage, karyopyknosis. The apoptotic rates of Huh7 cells in 24 h experimental group was 50.63%, significantly higher than that in 0 h control group (15.58%) (P=0.0001). Akt inhibitor pretreatment could synergize with quinalizarin to upregulate the expression levels of Bad and cleaved-caspase-3 protein, and downregulate the expression levels of p-Akt and Bcl-2 (P < 0.05). The intracellular reactive oxygen species (ROS) level was increased after quinalizarin treatment.

    Conclusion 

    Quinalizarin could inhibit the proliferation of Huh7 cells in a dose-dependent manner. Its mechanism may be related to quinalizarin down-regulating the expression of phosphorylated Akt or inducing the levels of ROS, and then to promote the Huh7 cells apoptosis.

     

  • 宫颈小细胞神经内分泌癌(small cell neuroendocrine carcinoma, SCNEC)是一种较为罕见的原发于宫颈的神经内分泌性肿瘤,约占宫颈恶性肿瘤的1%~2%[1-2]。在各种类型的宫颈癌中,SCNEC是一种侵袭性强的病理类型[3-8]。但因为该类病例较少,目前尚无规范化的治疗。本研究对101例宫颈小细胞神经内分泌癌患者的临床病理资料及生存状况进行分析,旨在探讨SCNEC合理的治疗方案及预后相关因素,为此类患者治疗及预后判断提供临床依据。

    收集2007年1月—2018年6月在江西省妇幼保健院确诊并完成治疗的101例宫颈小细胞神经内分泌癌患者作为研究对象。患者确诊年龄25~73岁,中位年龄44岁,其中41~50岁者有40例。宫颈局部肿瘤直径 > 4 cm患者34例,≤4 cm患者67例。患者临床资料及年龄分布见表 1。所有患者均知情同意。

    表  1  101例SCNEC患者临床病理特征
    Table  1  Clinical and pathological features of 101 SCNEC patients
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格

    (1)所有患者接受治疗前均经江西省妇幼保健院病理确诊为宫颈小细胞神经内分泌癌;(2)临床分期盆腔检查均经三位以上有经验的妇科肿瘤专业医师检查确定;(3)治疗前均未接受任何干预性治疗,且初始治疗及后续治疗均在同一机构完成;(4)纳入研究的患者治疗模式均为手术+术后补充放化疗(下文简称手术治疗组)或根治性放化疗,且按计划完成全部治疗;(5)全部患者术后病理检查均在同一医院完成;(6)建立了完整的病历档案,并持续随访,具备完整的住院及门诊复查病历资料。

    72例手术治疗患者手术方式为广泛子宫切除+盆腔淋巴结切除术±腹主动脉旁淋巴结切除术,其中47例行腹主动脉旁淋巴结切除术。69例行双附件切除,其余3例保留一侧卵巢且进行了保留卵巢的组织活检。

    放疗包括体外照射+腔内后装治疗,体外照射采用全盆腔体外照射+中央遮盖体外照射。体外照射剂量:全盆照射肿瘤剂量30~40 Gy,中央遮盖照射剂量15~25 Gy,放疗频率及强度:每周5次,每次分割剂量2 Gy。腔内后装采用高剂量率后装治疗设备,放射源为铱192。放疗剂量参照点A点累积剂量要求60~70 Gy;B点累积剂量要求54~56 Gy。放疗期间均给予铂类为基础的同步化疗。

    通过电话或门诊复查方式进行随访,截止时间为2018年9月。

    采用GraphPad7.0统计软件对不同组间患者生存率进行显著性比较。生存分析采用Kaplan-Meier法,生存率的比较采用Log rank检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

    72例手术组患者中,2例失访,19例死亡,51例生存。19例死亡患者生存时间1~63月,中位生存时间19月,平均生存时间18.5月。51例生存的患者中,生存时间1~139月,中位生存时间39月,平均生存时间47.3月。随访5年以上共33例,生存20例,五年生存率60.6%。

    29例根治性放化疗患者中,随访5年以上20例,其中2例失访,死亡15例,生存3例,五年生存率15%。生存时间1~75月,中位生存时间21月。3例生存患者年龄分别为40岁、41岁、46岁,临床分期均为ⅡB期,病理均为单纯的宫颈小细胞神经内分泌癌,化疗方案均为多西他赛+卡铂,放疗给予根治性同步放化疗。ⅠB1期~ⅡA期手术治疗组患者生存率优于ⅡB期~Ⅳ期期根治性放化疗组患者(P=0.0025),见图 1

    图  1  手术组与放化疗组患者生存曲线图
    Figure  1  Survival curves of Surgery and CCRT groups

    72例接受手术治疗的患者均行宫颈癌根治术+盆腔淋巴结切除术,47例行腹主动脉旁淋巴结切除术,其中1例(1/47, 2.12%)腹主动脉旁淋巴结阳性。27例(27/72, 37.5%)盆腔淋巴结阳性。淋巴结阳性与阴性患者生存曲线比较差异有统计学意义,淋巴结阴性患者生存优于淋巴结阳性患者(P=0.0004),见图 2

    图  2  盆腔淋巴结阳性和阴性手术患者生存曲线
    Figure  2  Survival curves of surgical SCNEC patients with pelvic lymph node positive and negative

    72例手术治疗的患者中,按病理类型分,单纯SCNEC例41例,混合其他病理类型者31例,其中混合有腺癌19例,鳞癌9例,腺鳞癌3例。混合型与单纯型SCNEC生存曲线比较差异无统计学意义(P=0.0546),见图 3

    图  3  单纯型与混合型SCNEC生存曲线
    Figure  3  Survival curves of pure and mixed type SCNEC patients

    WHO分类将宫颈神经内分泌肿瘤分为低级别神经内分泌肿瘤(包括类癌及非典型类癌)和高级别神经内分泌肿瘤(包括小细胞神经内分泌癌和大细胞神经内分泌癌)。目前无公认的、规范有效的治疗方案,对于宫颈神经内分泌肿瘤多参照常见宫颈癌的分期治疗原则,主张手术、化疗和放疗的综合性治疗,但其治疗是否应有别于宫颈鳞癌需要更大样本、多中心的研究。美国国立综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network, NCCN)指南也将SCNEC列入特殊类型宫颈癌。

    关于SCNEC患者生存率及预后方面的研究,Ishikawa等的一项多中心研究显示淋巴血管间隙受侵是患者的总生存率及无进展生存率的重要预后因素,盆腔淋巴结转移是DFS的重要预后影响因素[9]。Cohen等研究发现Ⅰ~ⅡA、ⅡB~ⅣA、ⅣB期5年生存率分别为36.8%、9.8%和0[10],本研究结果显示临床分期与预后密切相关,各期别5年生存率均较以往文献报道略高。FIGO分期是较为公认的影响患者预后的最重要的独立危险因素[11-12]。由于SCNEC侵袭性强,易发生远处转移,有学者认为早期SCNEC患者手术联合化疗的预后优于单纯手术者[13-14]。本研究中ⅠB~ⅡA期患者均采用手术+放化疗综合治疗,5年总生存率60%以上,提示手术联合术后放化疗对此类患者疗效较好。

    宫颈小细胞神经内分泌癌早期容易发生转移,但从72例早期患者手术情况发现,仅1例(1.39%)发生卵巢转移。提示对于存在生育要求的年轻SCNEC患者,是否一定要行卵巢切除有待进一步研究证实。研究证实,SCNEC好发转移器官为肺、脑、肝,预后差[15-16]

    此外,几乎所有文献均支持此类肿瘤早期即容易发生远处转移,本研究资料中,死亡病例主要病因为肺转移、全身转移,临床观察也支持上述观点。关于淋巴结转移,有研究认为,即使是早期的SCNEC患者,淋巴结转移也非常普遍,淋巴结转移率为41.6%~57%[17]。本研究中,72例早期SCNEC患者手术后病理提示淋巴结转移22例,转移率37.5%,与文献报道接近,但是对于腹主动脉旁淋巴结,72例患者中47例患者行腹主动脉旁淋巴结活检或切除,仅1例发生腹主动脉旁淋巴结转移,转移率仅为2.13%,远低于盆腔淋巴结转移率。这一研究结果提示我们,即便是早期SCNEC患者,化疗对于控制转移也有重要的临床意义。

    与以往报道相比,本研究中手术患者术后均补充了放化疗,且均达到6个疗程,其中49例采用紫杉醇+铂类化疗方案,23例采用顺铂+环磷酰胺+表阿霉素化疗方案,提示手术后放化疗的必要性。

    总之,宫颈小细胞神经内分泌癌发病率低、恶性程度高、易发生远处转移和复发,患者预后差、死亡率高、有独特的病理特征,诊断主要依据病理诊断和免疫组织化学结果可提高其诊断的准确率。由于研究样本少,尚需大量的临床资料及多中心研究探索最佳早期诊断及治疗的方法。

  • 图  1   不同浓度醌茜素处理人肝癌细胞24 h的存活率

    Figure  1   Viabilities of human hepatoma cells after different concentrations of quinalizarin treatment for 24h

    图  2   倒置显微镜下观察不同浓度醌茜素处理24 h Huh7细胞的形态变化(×200)

    Figure  2   Morphological changes of Huh7 cells after different concentrations of quinalizarin treatment for 24h (×200)

    图  3   醌茜素对肝癌Huh7细胞的诱导凋亡作用(×400)

    Figure  3   Apoptotic effect of quinalizarin on Huh7 cells (×400)

    图  4   不同时间醌茜素处理后对Huh7细胞内ROS水平的影响

    Figure  4   ROS levels in Huh7 cells treated with quinalizarin at different time points

    图  5   Western blot法检测醌茜素对Huh7细胞凋亡相关蛋白的影响

    Figure  5   Expression levels of apoptosis-related proteins in Huh7 cells treatment with quinalizarin detected by Western blot

  • [1] 吕桂帅, 陈磊, 王红阳.我国肝癌研究的现状与前景[J].生命科学, 2015, 27(3): 237-48. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-SMKX201503002.htm

    Lyu GS, Chen L, Wang HY. Research progress and prospect of liver cancer in China[J]. Sheng Ming Ke Xue, 2015, 27(3): 237-48. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-SMKX201503002.htm

    [2] 蒋昊, 文颂, 邵国良.原发性肝癌分子靶向药物临床研究进展[J].肿瘤防治研究, 2016, 43(5): 427-34. doi: 10.3971/j.issn.1000-8578.2016.05.023

    Jiang H, Wen S, Shao GL. Clinical advances of molecular-targeted therapy on primary hepatocellular carcinoma[J]. Zhong Liu Fang Zhi Yan Jiu, 2016, 43(5): 427-34. doi: 10.3971/j.issn.1000-8578.2016.05.023

    [3] 叶胜龙. 2013年肝癌领域新进展[J].中华肝脏病杂志, 2014, 22(1): 2-4. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-90115-1015521860.htm

    Ye SL.New advances in liver cancer research: A review of 2013[J]. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi, 2014, 22(1): 2-4. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-90115-1015521860.htm

    [4] 张江洲, 龙志雄.微波消融联合立体定向放疗治疗介入后原发和复发性肝癌的临床研究[J].肿瘤防治研究, 2014, 41(6): 649-52. doi: 10.3971/j.issn.1000-8578.2014.06.031

    Zhang JZ, Long ZX. Microwave ablation combined with stereotactic radiotherapy for primary and recurrent hepatocellular carcinoma after interventional treatment[J]. Zhong Liu Fang Zhi Yan Jiu, 2014, 41(6): 649-52. doi: 10.3971/j.issn.1000-8578.2014.06.031

    [5]

    Cozza G,  Mazzorana M,  Papinutto E, et al. Quinalizarin as a potent, selective and cell-permeable inhibitor of protein kinase CK2[J]. Biochem J, 2009, 421(3): 387-95. doi: 10.1042/BJ20090069

    [6]

    Pan X, Meng R, Yu Z, et al. Quinalizarin enhances radiosensitivity of nasopharyngeal carcinoma cells partially by suppressing SHP-1 expression[J]. Int J Oncol, 2016, 48(3): 1073-84. https://www.spandidos-publications.com/ijo/48/3/1073/abstract

    [7] 孟令旗, 刘畅, 孙虎男, 等.醌茜素对人肺癌A549细胞增殖、凋亡的影响及初步机制研究[J].中国药理学通报, 2016, 32(11): 1625-6. doi: 10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.029

    Meng LQ, Liu C, Sun HN, et al. Effects of quinalizarin on proliferation and apoptosis of human lung cancer A549 cells and its possible mechanism[J]. Zhongguo Yao Li Xue Tong Bao, 2016, 32(11): 1625-6. doi: 10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.029

    [8] 李珂, 周瑜, 张盛, 等.蛋白激酶CK2抑制剂-醌茜素在非小细胞肺癌中的抗肿瘤作用[J].中国医院药学杂志, 2016, 36(17): 1460-5. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-ZGYZ201617007.htm

    Li K, Zhou Y, Zhang S, et al. Anti-cancer effects of a protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin against non-small cell lung cancer[J]. Zhongguo Yi Yuan Yao Xue Za Zhi, 2016, 36(17): 1460-5. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-ZGYZ201617007.htm

    [9] 张盛, 李倩雯, 李珂, 等.蛋白激酶CK2抑制剂对H460细胞内活性氧水平及DNA双链断裂影响[J].中华放射肿瘤学杂志, 2016, 25(11): 1261-5. doi: 10.3760/cma.j.issn.1004-4221.2016.11.025

    Zhang S, Li QW, Li K, et al. Effect of a protein kinase CK2 inhibitor on intracellular levels of reactive oxygen species and DNA double-stand break in H460 cells[J]. Zhonghua Fang She Zhong Liu Xue Za Zhi, 2016, 25(11): 1261-5. doi: 10.3760/cma.j.issn.1004-4221.2016.11.025

    [10] 赵静静, 戴小军, 张晓春. Akt介导的信号通路在肿瘤淋巴管生成中的作用[J].肿瘤防治研究, 2016, 43(5): 422-6. doi: 10.3971/j.issn.1000-8578.2016.05.22

    Zhao JJ, Dai XJ, Zhang XC. Role of Akt-mediated signaling pathways in tumor lymphangiogenesis[J]. Zhong Liu Fang Zhi Yan Jiu, 2016, 43(5): 422-6. doi: 10.3971/j.issn.1000-8578.2016.05.22

    [11] 张雪群, 高卫, 潘盼, 等. PI3K/AKT及其相关因子在结肠癌中的表达[J].山东大学学报(医学版) 2016, 54(1): 52-7. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-SDYB201601017.htm

    Zhang XQ, Gao W, Pan P, et al. The expressions of PI3K/AKT and its related factors in colon cancer[J]. Shandong Da Xue Xue Bao(Yi Xue Ban), 2016, 54(1): 52-7. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-SDYB201601017.htm

    [12] 刘畅, 罗英花, 蒋雪园, 等.大黄素对人肝癌Huh7细胞的凋亡作用及机制研究[J].药物评价研究, 2016, 39(3): 367-71. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-YWPJ201603007.htm

    Liu C, Luo YH, Jiang XY, et al. Effect of emodin on inhibiting proliferation and inducing apoptosis in human hepatoma Huh7 cells and its mechanisms[J]. Yao Wu Ping Jia Yan Jiu, 2016, 39(3): 367-71. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-YWPJ201603007.htm

    [13]

    Gao H, Wang H, Peng J. Hispidulin induces apoptosis through mitochondrial dysfunction and inhibition of P13k/Akt signaling pathway in HepG2 cancer cells[J]. Cell Biochem Biophys, 2014, 69(1): 27-34. doi: 10.1007/s12013-013-9762-x

    [14]

    Yuan L, Wang J, Xiao H, et al. Isoorientin induces apoptosis through mitochondrial dysfunction and inhibition of PI3K/Akt signaling pathway in HepG2 cancer cells[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2012, 265(1): 83-92. doi: 10.1016/j.taap.2012.09.022

    [15] 张勇, 汤小玉, 李荣清, 等. PTEN、p-Akt在肝癌组织中的表达及其与上皮间质转化的关系[J].西南国防医药, 2014, 24(4): 349-52. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-XNGF201404002.htm

    Zhang Y, Tang XY, Li RQ, et al. Expression of PTEN and p-Akt in hepatocelluar carcinoma and their relationship with epithelial-mesenchymal transitions[J]. Xi Nan Guo Fang Yi Yao, 2014, 24(4): 349-52. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-XNGF201404002.htm

    [16] 张立功, 钱军. PI3K/Akt信号通路在肿瘤发展和治疗中的作用[J].安徽医药, 2012, 6(2): 149-51. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-AHYY201202003.htm

    Zhang LG, Qian J. Role of PI3K/Akt signaling pathway in tumor progress and treatment[J]. Anhui Yi Yao, 2012, 6(2): 149-51. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-AHYY201202003.htm

    [17]

    Shultz JC, Goehe RW, Wijesinghe DS, et al. Alternative splicing of caspase 9 is modulated by the phosphoinositide 3-kinase/Akt pathway via phosphorylation of SRp30a[J]. Cancer Res, 2010, 70(22): 9185-96. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-10-1545

    [18] 张嘉娣.活性氧的信号传导途径[J].安徽农业科学, 2010, 38(16): 8283-5. doi: 10.3969/j.issn.0517-6611.2010.16.002

    Zhang JD. Reactive Oxygen Species in Signal Transduction Pathway[J]. Anhui Nong Ye Ke Xue, 2010, 38(16): 8283-5. doi: 10.3969/j.issn.0517-6611.2010.16.002

图(5)
计量
  • 文章访问数:  1423
  • HTML全文浏览量:  354
  • PDF下载量:  571
  • 被引次数: 0
出版历程
  • 收稿日期:  2016-12-06
  • 修回日期:  2017-03-16
  • 网络出版日期:  2024-01-12
  • 刊出日期:  2017-07-24

目录

/

返回文章
返回
x 关闭 永久关闭