0   引言

脑胶质瘤血供丰富，应用抗血管生成治疗可在早期有效抑制其生长^[1]。近年来，研究者们在肿瘤中发现一种非血管内皮细胞构成的供血管道，其部分或全部管壁由肿瘤细胞构成，即血管生成拟态（vasculogenic mimicry, VM）^[2]。VM可能是肿瘤耐受抗血管生成药物的原因之一，并且VM的存在与否与脑胶质瘤患者的预后相关^[3]。因此，VM的形成机制值得深入研究。

目前，VM形成机制的主要信号通路框架已初步阐明。其中，基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMP）家族是该框架中的关键一环^[4]。既往研究发现，VM形成与肿瘤细胞侵袭力密切相关，抑制细胞侵袭可使VM形成能力显著下降^[5]。因此，MMP可能是抑制胶质瘤VM的靶点之一。MMP家族中目前发现与肿瘤侵袭关系密切的主要是MMP-2及MMP-9，在胶质瘤中其具体作用机制尚待阐明。

全反式维甲酸（all-trans retinoic acid, ATRA）是一种促分化剂，临床已用于血液肿瘤的治疗^[6]。前期研究中，我们发现全反式维甲酸可以体外诱导U87干细胞分化，并抑制其形成VM的能力，但其机制尚不完全清楚^[7]。既往研究发现，NF-κB是ATRA作用的下游信号通路^[8]，而NF-κB的磷酸化水平与MMP-2的活性相关^[9]。据此推测，ATRA可能通过NF-κB通路影响U87细胞MMP-2活性，抑制胶质瘤侵袭和迁移，从而抑制VM形成。本课题通过不同浓度的ATRA作用于U87细胞，初步探讨ATRA抑制其VM形成的机制，为证实ATRA的抗VM效应提供理论依据。

1   材料与方法

1.1   材料

人脑胶质瘤细胞系U87（博士德生物公司，上海），10%胎牛血清和胰蛋白酶（美国Hyclone公司），高糖DMEM培养液（美国Gibco公司），Matrigel基质胶（356230，Becton Dickson公司，美国），Transwell侵袭小室（上海博士德生物公司）。

1.2   细胞培养及分组

细胞培养液中添加双抗，临用前加10%胎牛血清，细胞置于37℃、5%CO₂培养箱中，每2天传代一次。实验设置3组，分别为阴性对照组（加入DMSO）、ATRA10组（加入ATRA 10 nmol/L，DMSO为溶剂）及ATRA100组（加入ATRA 100 nmol/L，DMSO为溶剂）。

1.3   细胞的三维培养及管道计数实验

将200 μl Matrigel基质胶于4℃过夜融化，并加入预冷的24孔板中，置于37℃培养箱中30 min固化。细胞消化离心后重悬，不加血清，接种于24孔板中，每孔接种5×10⁴个，37℃培养24 h后用倒置显微镜（×200）随机选取5个视野，每个视野的管道总长度取平均值进行比较。

1.4   侵袭小室实验

在孔径为8 μm的Transwell小室上层预先铺好50 μl稀释后的Matrigel基质胶；将各组细胞用无血清的培养液调整细胞密度为每毫升5×10⁵个后加入侵袭小室。按照说明书处理后，在光学显微镜下计数穿过Transwell小室聚碳酸酯膜的细胞（×200）。每组设2个复孔。

1.5   Western blot检测蛋白表达水平

冰浴中充分裂解细胞，取上清液。蛋白质经BCA法定量后电泳分离，并转移至PVDF膜上。封闭液封闭；随后分别加入一抗[兔抗人NF-κB（货号ab47336）及NF-κB p65（货号MAB72261），体积稀释比均为1:1000]，二抗[辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（体积稀释比均为1:500）]，最后采用ECL试剂显色，采集图像，应用Image J软件扫描灰度值。实验重复2次。以（NF-κB p65条带灰度值与NF-κB蛋白条带灰度值的比值）×100%表示目的蛋白的相对表达水平。

1.6   明胶酶谱仪检测MMP-2活性水平

细胞无血清培养24 h，收集上清液离心，SDS-PAGE电泳直至溴酚蓝跑出胶外，洗脱、漂洗后孵育，然后染色及脱色，MMP-2显示为位于蓝色背景上的透亮带，用凝胶图像分析系统读取条带吸光度值（OD），记录数据。实验重复2次。取人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养上清液所跑条带为参照。

1.7   统计学方法

数据采用SPSS13.0软件进行统计，并以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析One-way ANOVA及LSD-t检验（方差不齐时采用Games-Howell检验），P < 0.05为差异有统计学意义。

2   结果

2.1   ATRA对U87细胞形成VM的影响

三维培养及管道计数实验结果见图 1，对照组中胶质瘤细胞聚集成团，细胞团间相互连接，形成血管样结构，即血管生成拟态，每视野管道长度平均为（320.29±47.64）μm，ATRA10组管道样结构减少，每视野管道长度平均为（232.67±34.79）μm，较对照组明显减少（P < 0.001），ATRA100组管道样结构进一步减少，每视野管道长度平均为（39.27±14.33）μm，较对照组明显减少（P < 0.001），也少于ATRA10组（P < 0.001）。以上结果表明，随着培养液中ATRA浓度逐渐增高，U87细胞形成VM的能力逐渐减弱。

图  1  各组U87细胞三维培养及管道计数实验

Figure  1  3-D culture and tube formation assays of U87 cells in each group

Scale bar=200 μm; ^*: P < 0.001

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.2   ATRA对U87细胞侵袭力的影响

侵袭小室实验结果见图 2，对照组中U87细胞穿过Matrigel胶的数量为每视野（84.20±11.74）个，显著高于ATRA10组（43.67±8.66）个（P < 0.001）及ATRA100组（4.73±2.71）个（P < 0.001）；同时，ATRA100组细胞数与ATRA10组相比显著减少（P < 0.001）。以上结果表明，随着培养液中ATRA浓度逐渐增高，U87细胞侵袭力逐渐减弱。

图  2  各组细胞侵袭小室实验

Figure  2  Transwell assays of U87 cells in each group

Scale bar=50 μm, ^*: P < 0.001

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.3   ATRA对U87细胞中NF-κB信号通路的影响

Western blot结果见图 3，对照组NF-κB p65/ NF-κB为（21.05±1.18）%，显著高于ATRA10组（18.18±1.82）%（P=0.034）及ATRA100组（13.25±0.05%）（P < 0.001）；ATRA100组显著低于ATRA10组（P=0.003）。以上结果表明，随着ATRA浓度逐渐增高，NF-κB磷酸化水平逐渐减低。

图  3  各组细胞NF-κB p65及NF-κB蛋白表达水平

Figure  3  Protein expression of NF-κB p65 and NF-κB in each group

^*: P < 0.05, ^**: P < 0.01

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.4   ATRA对U87细胞MMP-2活性的影响

明胶酶谱分析结果见图 4，HUVEC的OD值作为参照值（593.67±22.50），对照组OD值为（1409.67±101.69），显著高于ATRA10组（1046.00±52.20, P=0.035）及ATRA100组（608.33±36.94, P=0.007）；同时，ATRA100组OD值与ATRA10组相比显著降低（P=0.002）。结果表明，随着ATRA浓度逐渐增高，U87细胞的MMP-2活性水平逐渐减低。

图  4  各组细胞培养上清液MMP-2活性水平

Figure  4  Activities of MMP-2 in cell supernatant of each group

^*: P < 0.05, ^**: P < 0.01

下载: 全尺寸图片 幻灯片

3   讨论

目前使用ATRA治疗恶性胶质瘤的基础研究获得了较好的效果^[10]。研究表明，ATRA抑制肿瘤生长的机制主要有四个方面：（1）抑制肿瘤细胞的增殖：ATRA通过与其受体结合，影响下游的信号通路包括AP-1、MAPK、PI3K-Akt、Wnt/β-catenin等。付锐等^[11]应用ATRA可显著抑制大鼠C6脑胶质瘤细胞增殖。（2）诱导肿瘤干细胞分化：肿瘤干细胞多处于G₀期，在ATRA作用下可以进入细胞周期以对称和（或）不对称方式进行分裂增殖，从而消除其多向分化潜能。刘轶靖等^[12]发现ATRA通过下调细胞因子如bFGF的分泌，阻止U87胶质瘤干细胞维持在未分化状态；（3）促进肿瘤细胞凋亡：ATRA可以下调细胞生存基因的表达，上调凋亡基因如caspase-3等的表达，从而促进细胞凋亡。Lu等^[13]观察到ATRA通过上调caspase-3诱导大鼠食管癌上皮细胞凋亡。（4）抑制肿瘤血管生成和细胞的侵袭及迁移：ATRA通过下调VEGF抑制肿瘤血管生成及VM形成^{[7, 12]}，并且通过抑制MMP的表达抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移。李海燕等^[14]发现ATRA可以通过下调肝癌细胞的MMP-9表达抑制其侵袭和迁移。至今，ATRA抑制脑胶质瘤VM形成的机制尚不完全清楚。

本实验结果显示，随着ATRA浓度的增高，U87细胞形成VM的能力逐渐下降，细胞穿过Matrigel基质胶的侵袭力也逐渐下降，表明细胞侵袭力与VM形成能力相关。细胞分泌的MMP-2活性水平随着ATRA浓度升高也逐渐下降，这与其他肿瘤中ATRA的效应相似^[14]。由于U87不分泌具有活性的MMP-9，我们认为MMP-2在胶质瘤的侵袭过程中起主要作用。那么，ATRA影响MMP-2活性的机制是什么呢？文献报道，胶质瘤中NF-κB信号通路异常高表达，并且伴有NF-κB的磷酸化水平升高，是MMP-2的激活通路之一^[15-16]。另一方面，NF-κB是ATRA发挥作用的下游信号通路之一^[17]。因此，本次实验检测了U87细胞的NF-κB磷酸化水平。结果发现，随着ATRA浓度升高，NF-κB磷酸化水平逐渐下降，表明ATRA很可能是通过抑制NF-κB信号通路，下调MMP-2活性，从而抑制U87细胞侵袭及形成VM。但是，NF-κB调节MMP-2的具体机制目前尚不完全清楚，一些学者认为可能是由于NF-κB信号通路在上皮-间充质转化效应（EMT）中起到了关键作用，使肿瘤细胞改造微环境的能力增强，体现在MMP-2分泌增多^[18]。

综上所述，ATRA在体外实验中抑制U87细胞的VM形成，这与细胞侵袭力受到抑制有关，细胞侵袭力下降又与MMP-2活性下降有关。ATRA的下游信号通路NF-κB受到抑制，这可能是MMP-2活性下降的原因之一。本研究的不足之处在于仅在体外环境、单个胶质瘤细胞系上研究ATRA对VM形成的影响，对ATRA在体内环境或其他细胞系的作用都有待今后的工作中继续探讨。