0   引言

目前，化学治疗仍是三阴性乳腺癌的主要治疗方法之一，但是肿瘤细胞对化疗药物的耐药性严重影响了治疗效果，化疗药物与肿瘤细胞的接触是诱导继发性耐药的主要原因^[1]。由于阿霉素是乳腺癌化学方案的常用药物^[2]，本研究观察阿霉素对三阴性乳腺癌耐药性的诱导作用并探究其机制。

ATP结合盒（ABC）转运蛋白在耐药的发展中起着至关重要的作用。ATP结合盒亚家族G成员2（ATP-binding cassette, sub-family G member 2, ABCG2）能排出大量异质化合物，导致耐药，引起治疗抵抗^[3]。细胞耐药性的产生及耐药蛋白的表达受多种转录因子的调控。有研究报道cMyc能够调控包括ABCG2在内的ABC转运蛋白的表达^[4]。cMyc是一个多功能的转录因子，参与调节细胞对阿霉素的敏感度^[5]，而cMyc的表达受其上游基因Stat3的调控。Stat3在肿瘤组织中异常激活，引发其下游靶基因cMyc转录，从而使正常细胞转化为癌细胞，并增加肿瘤细胞的耐药性^[6]。因此，本研究观察阿霉素对MDA-MB-468细胞耐药性的诱导作用并探讨Stat3-cMyc通路是否介导了耐药性的发生。

1   材料与方法

1.1   细胞株、试剂、仪器

人乳腺癌MDA-MB-468细胞株购自美国标准细胞库（American type culture collections, ATCC）。本研究实验剂和仪器包括：RPMI 1640培养基（Hyclone，美国）、青霉素/链霉素（索莱宝，北京，中国）、胎牛血清（四季青，杭州，中国）、阿霉素（索莱宝，北京，中国）、RIPA裂解液/苯甲基磺酰氟（索莱宝，北京，中国）、聚偏二氟乙烯膜（Millipore，Billerica，美国）、ABCG2抗体（Abcam，Cambridge，美国）、WP1066抑制剂（Selleckchem，上海，中国）和二甲基亚砜（索莱宝，北京，中国）等。

1.2   细胞培养

人乳腺癌MDA-MB-468细胞用含10%FBS和1%青霉素/链霉素的RPMI 1640在37℃、5%CO₂培养箱中培养。以不同浓度的阿霉素（0、0.05、0.1和0.5 μmol/L）孵育细胞24 h，观察并筛选最适阿霉素浓度进行后续实验。

1.3   MTT法检测

细胞以3 000个/孔的密度接种至96孔板，然后分别加入终浓度为0、0.05、0.1和0.5 μmol/L的阿霉素。24 h后，每孔加入20 μl MTT溶液（5 mg/ml）继续培养4 h，吸弃培养液，每孔加150 μl DMSO溶液，振荡15 min后测定570 nm处的吸光度（OD₅₇₀）。

1.4   细胞爬片及免疫荧光染色

将盖玻片置于24孔板孔底，分别将MDA-MB-468和MDA-MB-468/ADM细胞以1×10⁴个/孔接种，待细胞爬满盖玻片后进行免疫荧光染色。用PBS轻轻冲洗后在4%多聚甲醛中固定15 min。PBS洗涤爬片3次，山羊血清封闭1 h。将细胞用ABCG2一抗在4℃冰箱中孵育、过夜。PBS洗涤后，用二抗于37℃温育1 h。PBS洗涤细胞，用DAPI染色10 min，再次洗涤3次后滴加荧光防淬灭剂，观察免疫荧光染色并拍照。

1.5   蛋白质印迹分析

抽提各组细胞的总蛋白，利用BCA法测定总蛋白浓度，以每个泳道20 μg浓度的蛋白样品上样，经SDS-PAGE电泳后，利用半干电转化法将蛋白转移至PVDF膜上，经过封闭、一抗（稀释倍数1:1 000）孵育、TBST洗脱、HRP标记的二抗（稀释倍数1:5 000）孵育、TBST再洗脱等步骤后，用增强化学发光法检测信号及X线片曝光，并且经定影显影处理，获得清晰条带。

1.6   统计学方法

运用SPSS13.0统计软件进行分析，所有结果采用（x±s）表示，组间均数的比较采用独立t检验（双侧），P < 0.05为差异有统计学意义。

2   结果

2.1   持续低剂量阿霉素刺激诱导MDA-MB-468细胞产生耐药性

不同浓度阿霉素作用于MDA-MB-468细胞24 h后可见0.05 μmol/L与0.1 μmol/L浓度的阿霉素未引起细胞明显的损伤，大部分细胞生长良好。当浓度增加到0.5 μmol/L时，几乎所有细胞都受损，可见大量坏死细胞；MTT法测得在0.05 μmol/L、0.1 μmol/L及0.5 μmol/L浓度下阿霉素对MDA-MB-468细胞的抑制率分别为0.14、0.20、0.38，而且阿霉素对MDA-MB-468细胞的半数最大效应浓度（concentration for 50% of maximal effect, EC₅₀）为0.94 μmol/L（P=0.038）。综合以上结果，我们选用0.1 μmol/L的阿霉素继续进行后续研究。

用0.1 μmol/L的阿霉素持续刺激MDA-MB-468细胞4周后获得耐药细胞，命名为MDA-MB-468/ADM。MTT实验检测MDA-MB-468/ADM细胞对阿霉素敏感度，结果显示MDA-MB-468/ADM的EC₅₀为5.2 μmol/L，较MDA-MB-468的EC₅₀（0.94 μmol/L）显著升高（P=0.041），说明长期使用0.1 μmol/L的阿霉素后，MDA-MB-468细胞对阿霉素的敏感度显著下降，产生耐药，见图 1。

图  1  MTT测定经24h处理后的MDA-MB-468细胞与MDA-MB-468/ADM细胞对阿霉素的敏感度(x±s, n=3)

Figure  1  Sensitivity of MDA-MB-468 and MDA-MB-468/ADM cells to adriamycin after 24h treatment detected by MTT assay (x±s, n=3)

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2.2   MDA-MB-468/ADM细胞中高表达耐药蛋白ABCG2

与正常MDA-MB-468细胞相比，MDA-MB-468/ADM细胞中代表ABCG2表达水平的红色荧光明显增多增强，见图 2A。Western blot检测结果也表明了MDA-MB-468/ADM细胞中ABCG2的高表达，见图 2B。提示用0.1 μmol/L阿霉素持续刺激后，三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞对阿霉素产生耐药。

图  2  MDA-MB-468/ADM细胞中耐药蛋白ABCG2的表达

Figure  2  Expression of drug resistance protein ABCG2 in MDA-MB-468/ADM cells

A: Immunofluorescence staining results showed the increased expression of ABCG2 (red) in MDA-MB-468/ADM cells, staining with DAPI (blue); B: Western blot analysis results showed high expression of ABCG2 in MDA-MB-468/ADM cells (n=3, *: P < 0.05)

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2.3   MDA-MB-468/ADM细胞高表达p-Stat3与cMyc

为探究MDA-MB-468细胞对阿霉素产生耐药的机制，我们进一步检测了MDA-MB-468/ADM细胞中转录因子p-stat3与cMyc的表达水平，观察MDA-MB-468细胞对阿霉素耐药性的产生是否与Stat3-cMyc途径有关。Western blot结果显示，MDA-MB-468/ADM中p-Stat3与cMyc的表达均明显升高，而两组细胞中总的Stat3表达水平未见显著变化。这些结果表明Stat3的激活和cMyc表达的增多可能参与了MDA-MB-468细胞对阿霉素耐药性的产生，见图 3。

图  3  Western blot检测在MDA-MB-468和MDA-MB-468/ADM细胞中p-Stat3、Stat3及cMyc的表达(n=3, *: P < 0.05, **: P < 0.01)

Figure  3  p-Stat3, Stat3 and cMyc expression in MDA-MB-468 and MDA-MB-468/ADM cells analyzed by Western blot (n=3, *: P < 0.05, **: P < 0.01)

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2.4   抑制Stat3活化可下调cMyc及ABCG2的表达

为进一步证明Stat3-cMyc途径在阿霉素诱导三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞耐药性产生中的作用，我们用Stat3磷酸化的抑制剂WP1066抑制Stat3活化，观察转录因子cMyc的表达是否受到影响。结果显示WP1066（1.25 μmol/L）作用于MDA-MB-468/ADM细胞后，磷酸化的Stat3显著降低（P=0.014），同时cMyc表达水平明显下降（P=0.044）。另外WP1066处理后MDA-MB-468/ADM细胞耐药蛋白ABCG2的表达也显著减少（P=0.000）。这些结果进一步说明阿霉素通过Stat3-cMyc途径诱导了MDA-MB-468细胞耐药性的产生，而抑制Stat3的活化后，耐药蛋白表达减少，细胞的耐药性减弱，见图 4。

图  4  Western blot检测MDA-MB-468、MDA-MB-468/ADM、MDA-MB-468/ADM/WP1066三组细胞中p-Stat3、Stat3、cMyc及ABCG2的表达

Figure  4  Stat3, p-Stat3, cMyc and ABCG2 expression in MDA-MB-468, MDA-MB-468/ADM and MDA-MB-468/ADM/WP1066 cells analyzed by Western blot

*: P < 0.05, **: P < 0.01 (x±s, n=3)

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2.5   抑制Stat3活化增强了MDA-MB-468/ADM细胞对阿霉素的敏感度

由于WP1066下调了耐药蛋白ABCG2的表达，因此我们进一步通过MTT法检测MDA-MB-468/ADM细胞对阿霉素敏感度的变化。结果显示，阿霉素对MDA-MB-468/ADM细胞的EC₅₀为6.774 μmol/L，而在使用WP1066之后的EC₅₀降低至1.29 μmol/L（P=0.000），这表明WP1066抑制Stat3的活化增强了MDA-MB-468/ADM细胞对阿霉素的敏感度，见图 5。

图  5  MTT法检测经36 h处理后的MDA-MB-468、MDA-MB-468/ADM、MDA-MB-468/ADM/WP 1066三组细胞对阿霉素的敏感度(x±s, n=3)

Figure  5  Sensitivity of MDA-MB-468, MDA-MB-468/ADM and MDA-MB-468/ADM/WP1066 cells to adriamycin after 36h treatment detected by MTT assay (x±s, n=3)

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3   讨论

目前肿瘤细胞的耐药性是临床治疗的难点与研究的热点，阐明肿瘤耐药的机制可以为肿瘤的治疗提供新的治疗方向和靶点。

本研究应用低剂量阿霉素持续诱导人三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞，导致细胞产生耐药性，对阿霉素的敏感度显著下降，耐药蛋白ABCG2表达增高。为探究MDA-MB-468细胞对阿霉素产生耐药的机制，本实验进一步检测了MDA-MB-468/ADM细胞中转录因子p-stat3与cMyc的表达水平，观察MDA-MB-468细胞对阿霉素耐药性的产生与Stat3-cMyc途径有关。为进一步证明Stat3-cMyc途径在阿霉素诱导三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞耐药性产生中的作用，实验用Stat3磷酸化的抑制剂WP1066抑制Stat3活化，发现转录因子cMyc的表达也受到影响。进一步的机制研究揭示了Stat3-cMyc通路在阿霉素诱导的耐药中具有重要作用。

文献报道，Stat3信号通路与肿瘤细胞对化疗的耐药性有关^[7]。Stat3的激活可以帮助癌细胞逃避由药物引起的死亡，从而诱发耐药性。Yue等^[8]证明了Stat3的过度活化可以促进顺铂耐药的卵巢癌进展，相反，如果抑制Stat3信号通路则会促进耐药性癌细胞的凋亡，增加癌细胞对各种药物的敏感度。Li等^[9]研究也有相似的发现，抑制Stat3信号通路后人胃癌细胞的凋亡增强，耐药性减弱。那么Stat3在三阴性乳腺癌耐药性的产生中有何作用？文献报道，乳腺癌组织中Stat3的活化增强与乳腺癌的临床分期和侵袭转移密切相关^[10]。多种致癌性细胞因子与细胞膜的相应受体结合后导致Stat3与酪氨酸磷酸化通道相偶联后被激活，激活后的Stat3可在核内与特异性DNA启动子相结合，调节cMyc、Oct4、Sox2等相关基因表达^[11]。作为调节多种转录因子功能的重要枢纽，Stat3有望成为肿瘤基因治疗中的有效靶点。有研究表明，在肿瘤中cMyc的表达水平与耐药性有关^{[4, 12-13]}，cMyc能够调控ABC转运蛋白的表达水平，而ABCG2与肿瘤细胞的耐药性直接相关，但Stat3/cMyc在三阴性乳腺癌产生耐药性方面的影响及机制却未见报道。

本研究发现低浓度（0.1 μmol/L）阿霉素持续刺激使MDA-MB-468细胞对阿霉素的敏感度明显降低，MDA-MB-468/ADM细胞中p-Stat3和cMyc的表达较MDA-MB-468细胞显著增加，这些发现与上述文献中对Stat3和cMyc在肿瘤耐药性中的作用相一致。另外，刘丽等^[6]在喉鳞癌细胞的研究中也揭示了Stat3-cMyc通路的重要作用，与本研究的结果相吻合。由此推测，MDA-MB-468/ADM对阿霉素耐药的机制很可能与Stat3的激活和p-Stat3介导的cMyc表达的增多有关。为进一步证明Stat3-cMyc通路在阿霉素诱导的乳腺癌耐药性中的关键作用，本实验应用WP1066抑制MDA-MB-468/ADM中Stat3的活化，发现随着p-Stat3的降低，cMyc和ABCG2的表达也相应下降，这与Granato等^[14]证实抑制Stat3信号可下调cMyc的表达一致。再次MTT检测发现WP1066作用后MDA-MB-468/ADM细胞对阿霉素的敏感度显著增强，这与Li等^[9]研究结果一致。

总之，本实验结果表明阿霉素可以诱导Stat3活化，上调转录因子cMyc及耐药蛋白ABCG2的表达，促进了三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞对阿霉素耐药性的产生。因此，抑制Stat3的表达与活化可有效逆转乳腺癌对阿霉素的耐药性，特异性靶向Stat3-cMyc途径联合化疗药物治疗有望成为一种有效治疗乳腺癌的新措施，改善乳腺癌患者的预后。