Resveratrol Inhibits Non-small Cell Lung Cancer via Directly Targeting EGFR and c-Met Signaling Pathways
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摘要:目的
探讨白藜芦醇抑制非小细胞肺癌细胞增殖的分子机制。
方法非小细胞肺癌细胞用白藜芦醇处理24、48和72 h，MTS和软琼脂集落形成实验检测白藜芦醇对非小细胞肺癌的抑制作用，免疫印迹检测白藜芦醇对表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）和肝细胞生长因子受体（c-Met）表达水平及下游信号通路的影响，流式细胞术检测白藜芦醇对细胞周期的影响。
结果白藜芦醇剂量依赖性抑制非小细胞肺癌细胞的增殖。白藜芦醇抑制EGFR和c-Met信号通路磷酸化活化的同时下调了EGFR总蛋白及EGFR在胞膜和胞核的表达，同时降低了c-Met蛋白在胞膜的表达及c-Met蛋白60 kD大小剪切体在胞核的表达。白藜芦醇促进了A549细胞G0/G1期阻滞。
结论白藜芦醇通过靶向EGFR和c-Met信号通路抑制非小细胞肺癌细胞的增殖。
Abstract:ObjectiveTo investigate the mechanism of resveratrol-mediated inhibition effect on human non-small cell lung cancer.
MethodsNon-small cell lung cancer cells were treated with various concentrations of resveratrol for 24, 48 and 72 h, the proliferation was evaluated by MTS and soft agar assay. Meanwhile, the activation of EGFR and c-Met signaling pathways after resveratrol treatment was tested via immunoblotting. The subcellular localization of EGFR and c-Met were assessed by Western blot. Flow cytometry was conducted to detect cell cycle progression.
ResultsResveratrol inhibited the proliferation of non-small cell lung cancer cells in a dose-dependent manner. Moreover, resveratrol treatment not only suppressed the phosphorylation of EGFR and c-Met signaling pathways, but also resulted in the down-regulation of total EGFR protein expression level, as well as its localization on membrane and in nucleus. Additionally, resveratrol treatment decreased c-Met expression on membrane and inhibited the 60 kD cleaved variant of c-Met translocated into nucleus. Flow cytometry data demonstrated that resveratrol induced cell cycle G0/G1 arrest.
ConclusionResveratrol inhibits human non-small cell lung cancer via directly targeting EGFR and c-Met signaling pathways.
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Key words:
- Non-small cell lung caner /
- Resveratrol /
- EGFR /
- c-Met
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0 引言
肺癌是人类最主要的致死性恶性肿瘤之一。目前认为除遗传因素导致的易感性改变外，吸烟是肺癌最重要的高危因素，其次，电离辐射、肺部慢性感染和大气污染等因素也与肺癌的发生发展密切相关。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）约占肺癌的85%，由于大多数患者被确诊时已处于肿瘤晚期，NSCLC患者五年生存率不足15%[1-3]。探明新的肺癌发病机制，寻找其有效的化学预防及治疗手段可能为降低非小细胞肺癌的发病率及促进治愈带来新的希望。本研究以人非小细胞肺癌细胞系A549和HCC827为模型，观察白藜芦醇对其增殖的影响，并从表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）和肝细胞生长因子受体c-Met两条信号通路来对白藜芦醇抗非小细胞肺癌的分子机制进行初步探讨。
1 材料与方法
1.1 细胞系
人非小细胞肺癌细胞系A549和HCC827细胞购自美国ATCC公司。细胞用含有10%FBS和1%双抗生素的RPMI 1640培养液常规培养，每1~2天换液，细胞融合度达到80%时传代。
1.2 主要试剂、试剂盒、主要抗体和仪器
RPMI 1640培养液，胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）和双抗生素（青霉素和链霉素，P & S）购自美国Invitrogen公司；p-EGFR-Tyr1068（#3777）、p-ERK1/2-Thr202/Tyr204（#4370）、p-Akt-Ser473（#4060）、EGFR（#2085）、c-Met（#8198）、E-cadherin（#3195）、Lamin B1（#12586）、抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；β-actin（A5316）抗体、BME（Basal Medium Eagle）、常规化合试剂和白藜芦醇（纯度 > 98%）购自美国Sigma公司。α-Tubulin（sc-5286）、anti-rabbit IgG-HRP（sc-2004）和anti-mouse IgG-HRP（sc-2005）购自美国Santa Cruz公司，CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit购自美国Promega公司，细胞周期检测试剂盒购自美国BD生物公司，BCA蛋白定量试剂盒购自美国Pierce公司。
1.3 主要方法
1.3.1 MTS实验
将对数生长期细胞消化计数，按照2 000个/孔的密度接种于96孔板。次日，加入不同浓度的白藜芦醇于96孔板中共培养细胞，每个浓度准备3个平行孔。在加入白藜芦醇的24、48和72 h时间点分别加入20 µl的CellTiter 96® AQueous One Solution试剂，1.5 h后酶标仪490 nm读取吸光度值。
1.3.2 停泊非依赖生长（软琼脂集落形成）实验
首先，准备1.25%琼脂凝胶和2×BME并46℃保温备用。下层琼脂凝胶（180 ml体系，含不同浓度的白藜芦醇）含有：2×BME（70 ml），L-Glutamine（2 ml），Gentamicin（100 µl），1×PBS（18 ml），FBS（18 ml）。预热后加入1.25%琼脂凝胶（72 ml）。将准备好的下层琼脂凝胶和不同浓度的白藜芦醇混匀后迅速加入6孔板中，每孔3 ml，超净台中静置1 h，使其充分凝固。将对数生长期细胞消化计数，用含10%FBS的1×BME稀释成24 000/ml细胞悬液备用。取下层凝胶2.4 ml（含不同浓度的白藜芦醇），加入1.2 ml细胞悬液，轻轻吹打混匀，迅速加入含有下层凝胶的6孔板中，每孔1 ml。待上层琼脂凝固后，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，静置1~3周。用显微镜进行克隆统计。
1.3.3 亚细胞组分蛋白抽提
胞质胞膜蛋白的抽提按照Millipore公司ProteoExtrat Subcellular Proteome Extraction Kit说明书进行。步骤如下：将细胞消化后，1 000 r/min离心5 min。细胞沉淀加入1 ml含有蛋白酶抑制剂的Extraction BufferⅠ，重悬细胞，冰上轻轻搅拌裂解10 min。4℃、500~1000 r/min离心10 min。转移上清液至新的EP管，即为胞质蛋白提取物。将剩余的细胞裂解物沉淀加入1 ml含有蛋白酶抑制剂的Extraction BufferⅡ，冰上轻轻搅拌裂解30 min。4℃、5 000~6 000 r/min离心10 min。转移上清液至新的EP管中，即为胞膜蛋白提取物。将剩余的细胞裂解物沉淀加入500 µl含有蛋白酶抑制剂的Extraction Buffer Ⅲ，冰上轻轻搅拌裂解10 min。4℃、6 800~10 000 r/min离心10 min。转移上清液至新的EP管中，即为胞核蛋白提取物。
1.3.4 细胞总蛋白抽提及蛋白浓度测定和Western blot分析
将细胞（不少于1×107）消化离心后，加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA（25 mmol/L Tris.HCl pH7.6, 150 mmol/L NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS）细胞裂解液，冰上裂解5~10 min。经过适当超声破碎后，13 000 r/min，4℃离心15 min。将上清液转移至新的EP管中，即为总蛋白抽提液。蛋白浓度用BCA蛋白定量试剂盒测定。取蛋白在变性不连续SDS-PAGE电泳中分离并电转移至硝酸纤维膜。含蛋白的硝酸纤维膜置于5%脱脂牛奶中室温封闭1~2 h，再与特异性单克隆抗体4℃孵育过夜，1×PBST洗涤三次，每次10 min。二抗室温孵育1 h，1×PBST洗涤三次，每次10 min，加入ECL化学发光底物，X线片曝光、显影、定影。
1.3.5 流式细胞术检测细胞周期
将待检测细胞消化后，800 r/min离心5 min。弃上清液，加入适量1×PBS洗两次，离心弃上清液，细胞用70%乙醇4℃过夜固定。将固定好的细胞用1×PBS洗两遍，加入RNase A（50 mg/ml）37℃孵育30 min。再加入propidium iodide（50 mg/ml）避光、室温、孵育30 min，流式细胞术检测细胞周期。
1.3.6 裸鼠移植瘤实验
动物实验均获得中南大学伦理委员会的批准认证，并按照其相关操作规范严格执行。将六周龄裸鼠并分成两组，每组4只。将处于对数生长期的A549细胞消化计数，制成2.5×107/ml细胞悬液，按每只老鼠100 μl细胞悬液接种于右侧后腿上部（含2.5×106个细胞），待肿瘤体积达到50~100 mm3给予白藜芦醇腹腔给药处理（每只按20毫克/千克），一周给药两次。肿瘤体积用游标卡尺每2~3天进行一次大小测量。接种一月后，对裸鼠实施安乐死，收取组织标本并统计数据。
1.4 统计学方法
实验数据利用SPSS13.0统计软件包进行统计学分析，统计不同时间、不同组别间的比较采用多因素的方差分析，实验组与对照组间的比较采用t检验。P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 白藜芦醇抑制人非小细胞性肺癌细胞系的增殖
利用MTS的实验方法，首先检测了不同浓度白藜芦醇对NSCLC细胞系增殖的影响。结果显示，15 µmol/L白藜芦醇处理72 h（1.04±0.02, P=0.0419），30 µmol/L白藜芦醇处理48 h（0.47±0.04, P=0.0206）和72 h（0.70±0.038, P=0.0042），和60 µmol/L白藜芦醇处理24 h（0.27±0.02, P=0.042），48 h（0.38±0.02, P=0.0015）和72 h（0.54±0.08, P=0.0017）时能显著抑制A549细胞增殖，见图 1A，对于HCC827细胞，30 µmol/L白藜芦醇处理24 h（0.26±0.003, P=0.0055），48 h（0.37±0.004, P=0.0002），72 h（0.54±0.008, P=0.0099）和60 µmol/L白藜芦醇处理24 h（0.256±0.005, P=0.0042），48 h（0.34±0.0015, P=0.0001），72 h（0.433±0.0056, P=0.0046）能显著抑制其增殖，见图 1B。
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图 1 白藜芦醇抑制A549和HCC827细胞的停泊依赖性增殖Figure 1 Resveratrol inhibited anchorage-dependent growth of A549 and HCC827 cells*: P < 0.05, vs. 0 μmol/L resveratrol group; A: A549 cells; B: HCC827 cells通过软琼脂克隆形成实验，检测了白藜芦醇对NSCLC细胞克隆形成能力的影响。结果发现，15 µmol/L（2907±224, P=0.0182），30 µmol/L（1 707±17.5, P=0.0003）和60 µmol/L（256±46.1, P=0.0001）白藜芦醇显著抑制了A549和HCC827细胞的克隆形成能力，见图 2。尤其是HCC827细胞，15、30和60 µmol/L白藜芦醇处理时的克隆形成数分别为（1 089±172, P=0.011）、（484±56.7, P=0.006）和（78.7±16.2, P=0.0036）。60 µmol/L白藜芦醇几乎阻断了A549和HCC827细胞的克隆形成。这提示，白藜芦醇呈时间和剂量依赖性抑制人NSCLC细胞系的增殖。
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图 2 白藜芦醇抑制A549和HCC827细胞停泊非依赖生长Figure 2 Resveratrol inhibited anchorage-independent growth of A549 and HCC827 cells*: P < 0.05, **: P < 0.01, ***: P < 0.001, vs. 0 μmol/L resveratrol group; A: A549 cells; B: HCC827 cells2.2 白藜芦醇抑制c-Met和EGFR信号通路
Western blot结果显示，白藜芦醇处理明显抑制了A549细胞内HGF诱导的c-Met磷酸化和EGF诱导的EGFR活化，见图 3。白藜芦醇在下调c-Met和EGFR自身磷酸化的同时，剂量依赖性抑制了下游激酶Akt和ERK1/2的磷酸化。这种抑制效应虽然在白藜芦醇浓度为15 µmol/L时并不显著，但30 µmol/L浓度白藜芦醇非常明显的抑制了c-Met、EGFR、Akt和ERK1/2的磷酸化活化。这提示白藜芦醇对非小细胞肺癌细胞的增殖抑制作用可能与受体酪氨酸激酶c-Met，EGFR及其下游生长相关信号通路的抑制有关。
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图 3 白藜芦醇抑制A549细胞c-Met和EGFR信号通路的活化Figure 3 Resveratrol suppressed activation of c-Met and EGFR signaling pathways in A549 cellsA: c-Met signaling pathway; B: EGFR signaling pathway2.3 白藜芦醇抑制c-Met和EGFR的蛋白表达
进一步实验，检测了白藜芦醇对非小细胞肺癌细胞内EGFR和c-Met总蛋白及亚细胞表达水平的影响。结果发现，白藜芦醇剂量依赖性下调A549细胞内EGFR的总蛋白表达水平，见图 4A。EGFR在胞膜和胞核的表达抑制相对总蛋白表达抑制来说更为显著，见图 4B~4C。c-Met总蛋白表达水平在白藜芦醇浓度上升至30 µmol/L时下调明显，见图 4A，而且胞膜c-Met表达在30 µmol/L白藜芦醇处理下几乎被阻断，见图 4B，而且c-Met蛋白60 kD截短体在胞核的表达水平也出现了类似的抑制趋势，见图 4C。这一结果证明白藜芦醇能直接下调EGFR和c-Met蛋白的表达及其亚细胞定位的分布。
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图 4 白藜芦醇下调A549细胞内EGFR和c-Met的蛋白表达Figure 4 Resveratrol down-regulated expression of EGFR and c-Met in A549 cellsA: whole cell extract; B: membrane extract; C: nuclear extract研究发现，给予蛋白酶体抑制剂MG132处理后，显著抑制了白藜芦醇诱导的EGFR和c-Met蛋白表达下调。但MG132处理并不能明显的抑制60 µmol/L白藜芦醇诱导的EGFR蛋白表达下调，见图 5。这一结果提示，高浓度的白藜芦醇不仅能同时促进EGFR的泛素化降解，有可能同时抑制了EGFR的转录，或者是促进了EGFR的其他蛋白降解途径。
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图 5 白藜芦醇促进EGFR和c-Met蛋白泛素化降解Figure 5 Resveratrol promotes ubiquitination-mediated degradation of EGFR and c-Met2.4 白藜芦醇促进细胞周期G0/G1期阻滞
文献报道证实EGFR入核作为转录因子参与调控cyclinD1的表达[4]。通过免疫印迹发现，白藜芦醇处理确实能下调A549细胞内cyclinD1的表达，见图 6A，这可能与白藜芦醇抑制了EGFR的胞核表达有关。流式细胞术的结果也证实，15、30和60 µmol/L白藜芦醇处理时的G0/G1的细胞数从对照组的（29.5±1.65）分别增加为（36.5±1.18, P=0.0446），（48.9±2.21, P=0.0124）和（55.1±3.72, P=0.0142）。这一结果提示，白藜芦醇可能通过下调EGFR的入核进而抑制cyclinD1的表达，诱导细胞周期G0/G1期阻滞。
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图 6 白藜芦醇诱导细胞周期G0/G1期阻滞Figure 6 Resveratrol induced cell cycle G0/G1 arrest*: P < 0.05, vs. 0 μmol/L resveratrol group; A: the graph of cell cycle distribution; B: flow cytometry analysis of cell cycle; C: cyclinD1 expression2.5 白藜芦醇抑制A549移植瘤的生长
多项研究报道证实白藜芦醇具有体内抗肿瘤的效果，我们利用A549细胞进行了裸鼠移植瘤实验。结果表明，白藜芦醇具有明显的体内抑制肺癌肿瘤生长的效果，在A549细胞接种后的30 d，对照组瘤体体积达到近600 mm3（498.7±196.8），但白藜芦醇处理组瘤体体积不足300 mm3（243.5±108.7），两组差异有统计学意义（P=0.0474），见图 7A~7B，对照组瘤体质量（0.65±0.14）g约为白藜芦醇处理组（0.31±0.11）g的两倍（P=0.0491），见图 7C。而且白藜芦醇处理没有显著引起小鼠体重的减轻，这提示白藜芦醇没有明显的体内药物毒性，见图 7D。
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图 7 白藜芦醇抑制A549肺癌细胞裸鼠移植瘤生长Figure 7 Resveratrol inhibited xenogratfed tumor growth of A549 cells in nude mice*: P < 0.05, resveratrol treatment groups compared with vehicle group; A: photographs of tumors dissected from mice; B: tumor volume; C: tumor weight; D: average body weight3 讨论
肿瘤的化学预防是指利用天然或合成的化学物质减慢、阻止或逆转机体癌变的过程，目前已成为抗肿瘤研究的热门领域[5]。流行病学研究[6-7]发现白藜芦醇能明显降低肺癌、胰腺癌、皮肤癌、卵巢癌、胃肠癌、前列腺癌、乳腺癌和膀胱癌等多种肿瘤的发病率。体内外实验的结果表明，白藜芦醇主要通过诱导肿瘤细胞周期阻滞，促进凋亡，抑制肿瘤细胞侵袭转移及血管新生等来发挥其抗肿瘤效应[6-8]。随着对白藜芦醇防癌抗癌分子机制的进一步阐释，尤其是近年来对其抗肿瘤活性分子机制的剖析，白藜芦醇的抗肿瘤作用已越来越受到人们的重视。
EGFR是一个广泛表达的酪氨酸激酶生长因子受体，其过表达和其介导的下游信号通路异常活化与多种上皮来源的肿瘤发病密切相关。经典的EGFR信号转导通路主要依赖其酪氨酸激酶活性，在EGF等配体的诱导下，EGFR通过自身或与其他家族成员相互作用而发生二聚化活化，活化的EGFR通过激活Ras-Raf-MEK-ERK1/2、PI3-K-Akt-mTOR、JAK2-STAT3和PLC-γ-PKC-IKK等通路，参与调控肿瘤细胞的一系列恶性表型[9]。EGFR的扩增及异常活化是非小细胞性肺癌发病中常见的分子事件。正因如此，靶向EGFR的受体酪氨酸激酶抑制剂，如吉非替尼、厄洛替尼等已用于非小细胞性肺癌的临床治疗[10]。虽然这一类靶向药物的应用为肺癌的治愈带来了新的希望，但由于相当一部分患者并未发生EGFR的激活性突变，或者EGFR下游信号通路如Ras-Raf-MEK-ERK1/2和PI3-K-Akt-mTOR等的异常突变活化导致的吉非替尼等TKI（Tyrosine-Kinase Inhibitor）原发耐药，或由于c-Met扩增或EGFR的二次突变导致继发耐药的出现，使得EGFR靶向治疗受到了极大限制[11-13]。本研究发现，白藜芦醇抑制A549和HCC827细胞的停泊依赖增殖和软琼脂克隆形成，而且白藜芦醇剂量依赖性下调EGF诱导的EGFR和HGF诱导的c-Met及下游Akt和ERK1/2的磷酸化活化。这提示，白藜芦醇介导的A549和HCC827细胞的增殖抑制可能与这两条重要的信号转导通路被抑制有关。据文献报道[11]，c-Met的异常扩增是导致近20%吉非替尼继发耐药发生的重要原因，白藜芦醇对EGFR和c-Met信号通路的同时抑制，有可能为其联合非小细胞性肺癌的靶向治疗带来新的契机。
越来越多的证据表明，EGFR和c-Met等生长因子受体存在明显的胞核移位现象。研究发现，EGFR入核可以作为转录因子，直接参与调控靶基因的转录[4, 14]。EGFR可通过其核定位序列（nuclear location sequence, NLS）与输入素（importin-α/β）的相互作用而入核，或者是通过内化作用内吞入高尔基体并转入内质网，再通过其核定位序列，并在HSP70和importin-β的作用下转运入核。在多种恶性肿瘤[14-16]如肺癌、皮肤癌、宫颈癌、食管癌、乳腺癌、卵巢癌和膀胱癌的细胞核内均发现高水平的EGFR表达。EGFR的入核以及在核内所诱导的一系列信号级联反对肿瘤的恶性增殖及存活起着十分重要的作用，并参与了肿瘤细胞的放化疗抵抗及侵袭转移[14-16]。c-Met蛋白在2006年被首次报道表达于胞核[17]，该研究证实，c-Met蛋白在多种细胞系内均表达一个60 kD大小左右的截短体片段，而且，该片段以HGF非依赖的形式移位至胞核。随后有研究证实，c-Met入核与乳腺癌的恶性表型密切相关[18]。虽然不断有研究报道c-Met蛋白在肿瘤中存在明显的核移位[19]，但其移位的机制，以及其生物学功能到底如何都还有待进一步研究。
在非小细胞肺癌中，白藜芦醇剂量依赖性抑制EGFR和c-Met的总蛋白及胞膜表达量，EGFR和c-Met蛋白60 kD截短体在胞核的表达水平也随着白藜芦醇浓度升高被逐渐抑制。而且，也证实了白藜芦醇诱导的EGFR和c-Met蛋白表达下调与EGFR和c-Met的泛素蛋白酶体降解有关。白藜芦醇抑制EGFR的胞核表达下调了其对靶基因cyclinD1的转录激活，同时白藜芦醇显著抑制了A549细胞的体内成瘤能力。虽然本研究证实了c-Met蛋白的入核被白藜芦醇显著抑制，但在非小细胞肺癌中，c-Met蛋白在胞核内是否具可能具有转录共因子的功能，或者是具有其在乳腺癌中类似的促进肿瘤恶性表型的功能还不清楚。本研究从EGFR和c-Met介导信号转导通路的角度初步探讨了白藜芦醇抗非小细胞性肺癌的分子机制，为白藜芦醇用于非小细胞肺癌的化学预防或联合靶向药物用于临床治疗提供了实验依据。
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图 1 白藜芦醇抑制A549和HCC827细胞的停泊依赖性增殖
Figure 1 Resveratrol inhibited anchorage-dependent growth of A549 and HCC827 cells
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图 2 白藜芦醇抑制A549和HCC827细胞停泊非依赖生长
Figure 2 Resveratrol inhibited anchorage-independent growth of A549 and HCC827 cells
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图 3 白藜芦醇抑制A549细胞c-Met和EGFR信号通路的活化
Figure 3 Resveratrol suppressed activation of c-Met and EGFR signaling pathways in A549 cells
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图 4 白藜芦醇下调A549细胞内EGFR和c-Met的蛋白表达
Figure 4 Resveratrol down-regulated expression of EGFR and c-Met in A549 cells
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图 5 白藜芦醇促进EGFR和c-Met蛋白泛素化降解
Figure 5 Resveratrol promotes ubiquitination-mediated degradation of EGFR and c-Met
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