Autophagic Cell Death Induced by GANT61 Inhibits Proliferation of Human Breast Cancer Cell Line MCF-7
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摘要:目的
观察Hedgehog通路抑制剂GANT61对人乳腺癌MCF-7细胞的抑制作用。
方法GANT61作用MCF-7细胞后，通过流式细胞术检测细胞死亡；提取处理细胞总RNA和蛋白。分别采用Real-time PCR和Western blot检测Hedgehog通路SHH、Gli1、Gli2及自噬标志物LC3-Ⅱ表达；处理细胞固定后通过电子显微镜观察GANT61诱导的自噬体形态；自噬抑制剂3-MA处理细胞或自噬相关基因atg5 siRNA转染细胞后再用GANT61作用，流式细胞术检测细胞死亡数量。
结果GANT61能明显诱导MCF-7死亡，降低Hedgehog通路SHH、Gli1、Gli2表达水平，提高LC3-Ⅱ蛋白表达，并可诱导MCF-7细胞产生自噬体。3-MA及atg5 siRNA可减弱GANT61诱导的细胞死亡。
结论GANT61通过诱导自噬性细胞死亡机制发挥抗乳腺癌细胞活性。
Abstract:ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of GANT61 on human breast cancer cell line MCF-7.
MethodsCell death was measured by flow cytometry after GANT61 treatment; the total RNA and protein were extracted from the treated cells; the mRNA and protein expression levels of SHH, Gli1, Gli2 and LC3-Ⅱ were detected by Real-time PCR and Western blot, respectively. Autophagosomes formation was observed under transmission electronic microscopy (TEM). After that, 3-MA and atg5 siRNA were used to illustrate the relationship between autophagy and cell death.
ResultsGANT61 induced significantly the cell death of MCF-7 cells. The expressions of SHH, Gli1 and Gli2 were decreased; however, autophagy marker LC3-II expression was increased after GANT61 treatment. Meanwhile, autophagosomes could be observed under TEM. 3-MA and atg5 siRNA could inhibit GANT61-induced cell death.
ConclusionGANT61 inhibits the proliferation of human breast cancer cell line MCF-7 through autophagic cell death.
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Key words:
- GANT61 /
- Autophagic cell death /
- Breast cancer /
- MCF-7 cell
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0 引言
与其他大多数国家一样，乳腺癌也成为了中国女性最常见的癌症之一，每年中国乳腺癌新发数量和死亡数量分别占全世界的12.2%和9.6%[1]。自上世纪90年代以来，中国的乳腺癌发病率增长速度是全球的两倍多，其中城市地区尤为显著[1]。化疗是乳腺癌治疗的传统方法之一，尽管目前临床上有很多的化疗药物可供选择应用，但这些药物或由于疗效有限、不良反应大，或由于耐药性问题，严重影响乳腺癌的治疗效果，因此研制新型抗乳腺癌药物具有重要意义。近年来发现Hedgehog通路中关键分子Gli与多种肿瘤的发生有密切关系，Gli分子抑制剂GANT61与Gli结合后，可抑制肝癌、胰腺癌细胞的增殖[2-3]。鉴于Gli分子在肿瘤发生发展中的作用，本研究观察了Hedgehog通路中的Gli蛋白小分子抑制剂GANT61对乳腺癌细胞作用及其机制，以期为乳腺癌治疗提供新途径。
1 材料与方法
1.1 试剂
GANT61和3-MA购自美国MedChemExpress公司。PI检测试剂和RIPA裂解液由江苏南通碧云天生物科技有限公司提供。SHH、Gli1及Gli2抗体购自美国Abcam公司，LC-3多克隆抗体购自美国MBL公司。SYBGreen由大连TaKaRa公司提供。自噬相关基因5（autophagy related gene 5, atg5）siRNA由上海吉玛公司合成。Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司。
1.2 细胞培养
人乳腺癌细胞系MCF-7由第四军医大学实验动物中心保存。实验前复苏细胞，以含有10% FCS的RPMI 1640完全培养液于37℃、5%CO2培养至对数生长期后备用。
1.3 atg5 siRNA转染
MCF-7接种6孔板，细胞贴壁后，10 pmol/L atg5 siRNA（正义: 5'-GACGUUGGUAACUGACAAATT-3'，反义: 5'-UUUGUCAGUUACCAACGUCTT-3'）与7.5 μl Lipofectamine 2000混合，室温作用20 min后加入培养孔，48 h后收集细胞进行检测。
1.4 流式细胞术检测
3×105个每孔的MCF-7细胞接种于6孔板，细胞贴壁后次日分别加入终浓度为5、10及20 μmol/L的GANT61共孵育，每个浓度设三个复孔。作用12、24及48 h后收集细胞，PBS洗脱后加入PI缓冲液，4℃避光作用15 min后以流式细胞术检测细胞死亡情况。检测自噬性细胞死亡时，先以3-MA预处理细胞1 h或atg5 siRNA转染24 h以抑制自噬发生，然后加入10 μmol/L GANT61共孵育24 h并通过流式细胞术检测细胞死亡情况。
1.5 Real-time PCR检测Gli1、Gli2、SHH分子mRNA表达
按参考文献[4]进行，MCF-7细胞以5、10及20 μmol/L的GANT61处理24 h，收集细胞，TRIzol提取细胞总RNA。以提取的RNA为模板进行cDNA合成，通过Gli1、Gli2、SHH特异性引物进行Real-time PCR反应，见表 1。反应条件为94℃预变性15 s，94℃变性30 s，65℃退火30 s，共进行40个循环。Gli1、Gli2、SHH分子mRNA表达水平用2-∆∆CT进行相对定量分析。
表 1 Gli1、Gli2、SHH real time PCR引物Table 1 Real time PCR primer of SHH, Gli1 and Gli2
1.6 Western blot检测蛋白表达
细胞用GANT61处理后，加入适量含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液提取蛋白，定量后每孔加入30 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳并转膜，5%BSA封闭后以一抗4℃孵育过夜，洗脱后加入二抗，化学发光法检测信号。
1.7 电子显微镜检测自噬体
MCF-7细胞以10 μmol/L的GANT61处理24 h，收集细胞，20%锇酸固定过夜，丙酮脱水后包埋。制备的样品以透射电子显微镜下观察自噬体形态。
1.8 统计学方法
本实验中所得数据采用SPSS13.0软件进行统计学处理，多组比较用方差分析，与对照组比较采用t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 GANT61诱导细胞死亡
GANT61处理后，PI染色阳性细胞即为死亡细胞，以流式细胞仪在488 nm处分析PI染色阳性细胞。结果表明不同浓度GANT61作用于MCF-7细胞后，可诱导细胞发生死亡现象，且这种现象呈现出一定的时间-浓度依赖性，随着作用时间的延长和药物浓度的增加，细胞死亡现象越明显，见图 1。
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图 1 不同浓度GANT61诱导MCF-7细胞死亡Figure 1 MCF-7 cells death induced by different concentration of GANT61*: P=0.0004, P=0.0002, P=0.0002, compared with control group under 5, 10, 20μmol/L GANT61 treatment; #: P=0.0004, P=0.0001, P=0.0001, compared with control group under 5, 10, 20μmol/L GANT61 treatment; △: P=0.0002, P=0.0001, P=0.0001, compared with control group under 5, 10, 20μmol/L GANT61 treatment2.2 GANT61抑制SHH、Gli1、Gli2 mRNA表达
SHH蛋白及下游转录因子Gli1、Gli2是Hedgehog信号通路中重要的调控分子，为探索GANT61对乳腺癌细胞的作用机制，用不同浓度GANT61处理MCF-7细胞24 h，观察SHH、Gli1及Gli2表达的变化，结果发现GANT61可同时抑制SHH、Gli1及Gli2 mRNA和蛋白水平的表达，随着浓度的增加，这种抑制效应越明显，见图 2。
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图 2 不同浓度GANT61处理后MCF-7细胞SHH、Gli1、Gli2表达Figure 2 SHH, Gli1 and Gli2 expression in MCF-7 cells treated with different concentration of GANT61A: relative mRNA expression of SHH, Gli1 and Gli2; *: P=0.047, P=0.014, P=0.009, compared with control group under 5, 10, 20μmol/L GANT61 treatment; #: P=0.029, P=0.014, compared with control group under 10, 20μmol/L GANT61 treatment; △: P=0.040, P=0.022, compared with control group under 10, 20μmol/L GANT61 treatment; B: melt curves of real time PCR; C: SHH, Gli1 and Gli2 protein expression detected by Western blot2.3 GANT61诱导MCF-7发生自噬
自噬标志物LC3-Ⅱ表达水平决定自噬水平高低，当自噬水平升高时，LC3-Ⅱ表达增强，且LC3-Ⅱ/β-actin及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值也增加。不同浓度GANT61作用于MCF-7细胞后自噬蛋白LC3-Ⅰ表达降低，LC3-Ⅱ表达逐渐升高。表达目的蛋白条带通过灰度扫描后发现LC3-Ⅱ/β-actin及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例均增加。GANT61处理后胞质中可见到多个由单层膜或双层膜组成的自噬体出现，但对照组细胞却未观察到自噬体，见图 3。表明GANT61可诱导细胞发生明显的自噬。
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图 3 GANT61诱导细胞自噬的产生Figure 3 Cell autophagy was induced by GANT61A: LC3 expression detected by Western blot; B: autophagosomes formation observed under transmission electronic microscopy (black arrows)2.4 自噬抑制后GANT61诱导细胞死亡能力降低
应用自噬抑制剂3-MA阻断GANT61诱导的自噬，发现在3-MA的作用下，细胞死亡现象减少；进一步通过siRNA技术沉默自噬相关基因agt5表达后，也观察到细胞死亡减少现象，表明GANT61介导的细胞死亡是通过自噬功能实现的，见图 4。
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图 4 3-MA (A)和atg5(B) siRNA抑制GANT61诱导的细胞死亡Figure 4 3-MA (A) and atg5(B) siRNA inhibited GANT61-induced cell death**: P=0.00033 讨论
Hedgehog（HH）信号通路调控细胞分化、组织发育及器官形成。在脊椎动物体内发现了3个HH家族成员，分别是Sonic Hedgehog（SHH）, Desert Hedgehog（DHH）和Indian Hedgehog（IHH）。HH信号通路包含Hh配体、膜蛋白受体Patched和Smoothened蛋白；此外，下游的转录因子Gli蛋白（Gli1、Gli2、Gli3）也参与SHH通路调控。
HH基因可以维持正常的细胞增殖，调节不同类型祖细胞分化，保持成体干细胞的自稳态，HH信号通路失调可以导致肿瘤的发生。HH配体活化后与膜受体Patched蛋白结合，通过VitD3抑制下游Smoothened蛋白的活性，继而影响到下游转录因子Gli的激活。作为Hh信号通路的关键分子，转录因子Gli调控该信号通路的活性，HH通路许多生物学活性都是通过Gli分子来实现的。研究发现，多个不同类型肿瘤标本中Gli1分子表达高于正常组织或癌旁组织[5-6]，提示Gli分子可能参与肿瘤的发生、发展过程。因此以Gli蛋白为对象，开发针对Gli蛋白的靶向药物可能是肿瘤预防或治疗的一个途径。GANT61是小分子抑制剂，选择性作用于Hh通路中的Gli1和Gli2分子，从而抑制Hedgehog通路活性，在多个组织来源不同的肿瘤细胞中已证实GANT61具有良好的抗肿瘤活性，可明显抑制肾癌、胰腺癌、肺癌细胞的生长[7-9]。本研究结果也证实GANT61对乳腺癌MCF-7细胞有明显抑制作用，能促使MCF-7细胞发生死亡。作为Gli分子的抑制剂，GANT61可以抑制Gli1和Gli2的表达，但本研究同时也观察到GANT61对Gli1和Gli2的上游分子SHH也有抑制作用，推测GANT61可能是通过抑制SHH/AKT-mTOR信号后产生这种现象[10]。
自噬是细胞维持自身稳态的过程，应急条件下，如饥饿、缺氧或药物刺激可促使细胞发生自噬，当自噬产生后，通过自噬体与溶酶体融合将衰老细胞器、错误折叠的蛋白等降解。PI3K/Akt/mTOR、MAPK及Hedgehog信号通路调控自噬形成[4, 11]，Hedgehog信号通路中SHH、Gli1及Gli2分子表达抑制后可诱导自噬产生，而Gli3对自噬功能没有影响[12-13]，因此本研究重点观察了GANT61对SHH、Gli1及Gli2表达的影响，而未对Gli3进行研究。本研究观察到GANT61作用后SHH、Gli1及Gli2表达水平降低，这可能是GANT61调控自噬形成的分子机制。近年来研究表明自噬也参与肿瘤的发生、发展，自噬可导致肿瘤细胞发生不同于凋亡的细胞死亡形式-自噬性细胞死亡，这是自噬发挥抗肿瘤活性的重要机制。能诱导细胞死亡、可产生自噬流、以自噬抑制剂处理或沉默自噬相关基因后能阻止细胞死亡是判断是否发生自噬性细胞死亡的金标准[14]。本研究中GANT61处理MCF-7细胞后可发生细胞死亡；同时电子显微镜下可观察到自噬小体出现，Western blot结果表明自噬标志物LC3-Ⅱ表达不仅升高，而且LC3-Ⅱ/actin及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例增加，表明有明显的自噬流产生；进一步以3-MA或atg5 siRNA抑制自噬后细胞死亡现象减轻，这些现象证明GANT61抗乳腺癌细胞活性通过诱导自噬性细胞死亡机制实现的。
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图 1 不同浓度GANT61诱导MCF-7细胞死亡
Figure 1 MCF-7 cells death induced by different concentration of GANT61
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图 2 不同浓度GANT61处理后MCF-7细胞SHH、Gli1、Gli2表达
Figure 2 SHH, Gli1 and Gli2 expression in MCF-7 cells treated with different concentration of GANT61
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图 4 3-MA (A)和atg5(B) siRNA抑制GANT61诱导的细胞死亡
Figure 4 3-MA (A) and atg5(B) siRNA inhibited GANT61-induced cell death
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