0   引言

三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer, TNBC）是近年来乳腺癌研究关注的焦点，其缺乏雌激素受体（estrogen receptor, ER)、孕激素受体（progesterone receptor, PR）、人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2, HER2）表达，和非三阴性乳腺癌（N-TNBC）相比，生存期短，临床预后差，老年患者和年轻患者有着相似的生存率^[1-2]。

E-cad由位于染色体16q22.1的CDH1基因合成，是一种细胞黏附分子，介导细胞分子识别和结合，与肿瘤浸润和转移有关^[3]。而VEGF是一种重要的血管生成调控因子，过度表达会导致细胞增殖和迁移；促进肿瘤新生血管的形成，与肿瘤生长关系密切^[4]。

中国是幅原辽阔的多民族国家，中国人的遗传背景在大致相似的基础上又各有地方特色，有研究显示不同民族TNBC分子生物学特征也不尽相同，与汉族比较，维吾尔族TNBC乳腺癌患者肿块较大、分期偏晚^[5-6]，本研究通过检测中国新疆地区汉、维吾尔族女性TNBC患者组织中E-cad及VEGF的阳性表达情况，分析其是否存在差异，并探讨其与预后间的关系，为不同民族TNBC患者的异种亚型分析提供数据^[7]，同时也为进一步了解影响TNBC患者的预后因素提供一定的依据。

1   资料与方法

1.1   一般资料

收集2008年3月至2010年3月于新疆医科大学附属肿瘤医院住院的乳腺癌患者818例，选择其中ER、PR以及HER2经我院免疫组织化学确认均为阴性的患者197例。其中汉族患者140例，维吾尔族患者57例，见表 1。纳入标准：（1）我院首次治疗的可手术的汉、维吾尔族女性乳腺癌患者；（2）临床病理资料完整；（3）ER、PR及HER2表达均阴性的患者。

表  1  汉族与维吾尔族TNBC分布情况

Table  1  Distribution of the TNBC in Han and Uygur

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1.2   免疫组织化学染色

采用PV-9000法测定E-cad、VEGF的表达，试剂盒及兔抗人E-cad单抗、鼠抗人VEGF单抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，一抗稀释度均为1:100，实验严格按照质量控制内容进行操作。组织经10%甲醛固定，石蜡包埋，4 μm连续切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，3%过氧化氢封闭内源性过氧化氢酶，滴加一抗、二抗，DAB染色，苏木精对比染色。用已知阳性表达的癌组织作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照，结果采取两人双盲法观察切片。

1.3   结果判读标准

E-cad及VEGF结果判读：两者按阳性细胞所占比例：阴性表达为细胞质内棕褐色染色 < 25%，分值为0分；低度阳性（+）表达为25%~ < 50%细胞质内呈棕褐色染色，分值为1分；中等强度（++）表达为细胞质内染色50%~75%，2分；强阳性（+++）表达为细胞质内染色 > 75%，细胞质内弥漫棕褐色染色，分值为3分。按染色程度：无阳性染色为０分，细胞轻度着色为１分，中度着色为２分，重度着色３分。最后分别将E-cad和VEGF的分值相加，总分值≤2分为阴性， > 3分为阳性。

1.4   随访

采用入院定期复查和电话追踪等随访方式，将患者手术开始时间定为起始时间，复发转移为终止事件，随访时间以月为单位，总时间为5年，随访截至2015年3月30日。

1.5   统计学方法

采用SPSS18.0统计软件进行数据处理，两组比较采用χ²检验；E-cad和VEGF与淋巴结转移数、TNM分期及组织学分级比较采用Spearman秩相关分析，Kaplan-Meier法计算5年无瘤生存情况，两组曲线比较用Log rank检验，α=0.05为检验水准。

2   结果

2.1   E-cad和VEGF在不同民族TNBC患者组织中的表达情况

PV9000免疫组织化学染色结果显示E-cad和VEGF阳性表达均位于肿瘤细胞的细胞膜和细胞质中，呈棕黄色或棕褐色，见图 1。140例汉族患者E-cad阳性表达68例，阳性率为48.6%，57例维吾尔族患者E-cad为20例，阳性率35.1%，汉族VEGF阳性表达66例，阳性率为47.1%，维吾尔族VEGF为36例，阳性率为63.2%，汉族女性TNBC患者VEGF阳性率表达低于维吾尔族女性患者，差异有统计学意义（P < 0.05），但E-cad的表达，两组无明显差异，见表 2。

图  1  E-cad和VEGF免疫组织化学结果(PV-9000, DAB×200)

A: positive expression of E-cad; B: negative expression of E-cad; C: positive expression of VEGF; D: negative expression of VEGF

Figure  1  E-cad and VEGF immunohistochemical expression results (PV-9000, DAB×200)

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表  2  E-cad和VEGF在汉族与维吾尔族TNBC患者组织中的表达情况[n(%)]

Table  2  The compare of E-cad and VEGF in Han and Uygur TNBC [n(%)]

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2.2   E-cad和VEGF在不同民族TNBC淋巴结分组中的表达情况

通过比较汉族与维吾尔族女性TNBC患者E-cad及VEGF在不同淋巴结分组的表达情况显示，随着淋巴结转移个数的增加，E-cad的阳性表达逐渐降低，未发生淋巴结转移情况下汉族E-cad表达为61.8%，维吾尔族为56.5%，而在发生淋巴结转移的情况，特别是≥4个时，汉族E-cad阳性表达只有29.6%，维吾尔族为14.3%。两者呈负相关关系（-1≤r < 1, P < 0.05）。VEGF的阳性表达则逐渐增高，VEGF阳性表达≥4个淋巴结组汉族为74.1%，维吾尔族为85.7 %；两者呈正相关关系（0 < r < 1, P < 0.05），见表 3。

表  3  E-cad和VEGF在汉族与维吾尔族TNBC患者淋巴结分组中的表达情况

Table  3  The compare of E-cad and VEGF with Lymph node in Han and Uygur TNBC

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2.3   E-cad和VEGF在不同民族TNBC患者TNM分期中的表达情况

两组患者E-cad的阳性表达Ⅰ期均高于Ⅱ、Ⅲ期，而VEGF的阳性率Ⅲ期均高于Ⅰ、Ⅱ期，相关性分析结果提示：随着TNM临床分期的增高，两组患者E-cad的表达缺失情况逐渐升高，差异有统计学意义（-1≤r < 1, P < 0.05）；VEGF的阳性率则随TNM增高而逐渐增高，差异有统计学意义（0 < r < 1, P < 0.05），见表 4。

表  4  E-cad和VEGF在汉族与维吾尔族TNBC患者TNM分期中的表达情况

Table  4  The compare of E-cad and VEGF with TNM in Han and Uygur TNBC

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2.4   E-cad和VEGF在不同民族TNBC组织学分级中的表达情况

E-cad在汉族与维吾尔族女性TNBC组织学分级越高，其表达缺失更明显，两者呈负相关关系，差异有统计学意义（-1≤r < 1, P < 0.05）；而VEGF表达与组织学分级无明显相关，差异无统计学意义（P > 0.05），见表 5。

表  5  E-cad和VEGF在汉族与维吾尔族TNBC患者组织学分级中的表达情况

Table  5  The compare of E-cad and VEGF with grade in Han and Uygur TNBC

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2.5   复发转移情况比较

所有病例均完成定期随访复查，截至2015年3月，汉族TNBC患者复发转移37例（37/140, 26.4%），维吾尔族患者复发转移19例（19/57, 33.3%），Log rank=1.163, P=0.281，5年无瘤生存情况两组差异无统计学意义，见图 2。

图  2  两组三阴性乳腺癌患者5年无瘤生存情况

Figure  2  5 year Disease free survival rate of TNBC

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3   讨论

TNBC分子生物学特征复杂，与N-TNBC相比，有着不同的临床病理特征及预后。E-cad与VEGF对肿瘤的发生发展都起到重要作用，本文就TNBC在汉、维族间的E-cad、VEGF表达差异做一分析研究，进一步了解影响TNBC的发生发展因素。

E-cad是一种细胞黏附分子，其跨膜糖蛋白结构分布三个不同的区域：分别为胞质内，跨膜区和细胞外。其中胞质部分起到信号转导的作用^[8]。E-cad在细胞运动和肿瘤发生侵袭期间上皮-间质转化进程以及外渗和迁移过程中起关键作用^[9]，E-cad表达的缺失是上皮肿瘤侵袭和转移能力的关键^[10]。研究表明，E-cad的低表达是肿瘤预后差的标志，与DFS显著相关^[11-12]。

VEGF可与血管内皮细胞发生特异性结合，刺激血管内皮细胞增殖，促进肿瘤新生血管形成，为肿瘤细胞的转移提供基础，与肿瘤生长关系密切^[13]。研究显示，VEGF在TNBC中的高表达与其5年生存率差有明显关系，VEGF高表达提示预后较差^[14-15]。其有可能成为TNBC治疗的新靶点^[16]。研究显示，贝伐单抗(抗VEGF抗体)联合表阿霉素+环磷酰胺+多西他赛方案使TNBC患者的病理缓解率从27.9%增加至39.3%^[17]。

本研究结果显示汉、维吾尔族女性TNBC中E-cad的表达差异无统计学意义；而VEGF阳性表达两组差异有统计学意义，汉族组明显低于维吾尔族组，产生此种差异的原因，可能与维吾尔族TNBC患者就诊时病期较晚有关，需进一步研究证实。

研究认为，肿瘤细胞的侵蚀能力与E-cad表达水平呈负相关^[18]，通过技术干扰过表达E-cad可有效抑制肿瘤细胞的侵蚀能力^[19]，E-cad在TNBC的发生发展过程中，起到重要作用，可以作为TNBC的预后指标^{[11, 20]}，本研究中，无论是在汉族组，还是维吾尔族组，观察到E-cad的表达与淋巴结转移状态、TNM分期及组织学分级呈负相关关系，随着淋巴结转移数目的增多、临床分期越晚、组织学分级越高，E-cad的表达缺失越明显，而E-cad的表达缺失，影响着TNBC患者的预后，国内一项研究显示：E-cad阴性患者的5年总生存率和无病生存率均低于E-cad阳性患者^[21]。

VEGF在TNBC中过表达，与淋巴结转移、肿瘤分期有一定相关性，且易致TNBC早期复发、转移，通常预后较差^[22]。有项对复发TNBC的研究认为^[23]，在TNBC的不同阶段，VEGF基因表达分布也显著不同，本研究显示，VEGF阳性表达率与汉族、维吾尔族TNBC患者的淋巴结转移数目及TNM分期呈现正相关关系，VEGF阳性表达随着淋巴结转移数目及TNM分期的增高而逐渐升高，说明VEGF在TNBC的进展过程中起到了一定作用，但与组织学分级没有明显相关，与国外报道研究一致^[24]。

通过随访发现汉族与维吾尔族TNBC患者5年无瘤生存率无差别，但VEGF阳性率表达差异有统计学意义；表明VEGF可作为判断TNBC预后的独立因素，当其在乳腺癌患者中高表达时，往往提示预后较差^[25]。本研究发现VEGF在维吾尔族TNBC患者的阳性表达率高于汉族患者，但两者的5年无病生存率无明显差别，同时两组E-cad的表达差异也没有统计学意义，而有文献报道，在非三阴性乳腺癌的预后当中，维吾尔族Lumina A型乳腺癌患者6年无瘤生存率低于汉族患者^[5]，因此推测，维吾尔族TNBC患者的预后，可能存在与汉族女性患者不同的影响因素，由于本研究样本量较少，建议增加样本量进一步研究证实。