0   引言

巨噬细胞移动抑制因子（macrophage migration inhibitory factor,MIF）作为炎症细胞因子，存在于淋巴细胞、巨噬细胞及各种组织实质和间质细胞中，具有多种生物活性，在内毒素休克、炎性反应、移植排斥反应等中起重要作用。目前发现MIF是一种独特的促进恶性肿瘤发生发展的细胞因子，几乎参与了肿瘤发生、发展的全部阶段^[1]。MIF在大多数肿瘤中表达并参与肿瘤发展的过程，使其有可能成为肿瘤治疗的新靶点^[2-3]。本研究采用免疫组织化学法检测在手术切除的贲门癌标本中MIF的表达，探讨其与患者临床病理特征、预后的关系。

1   资料与方法

1.1   临床资料

选取滨州医学院附属医院胸外科2008年1月—2009年12月经胸手术切除的贲门癌石蜡标本73例，其中男64例、女9例，年龄41~81岁，中位年龄64岁。所有病例均有完整的临床病理资料，见表 1。根据第7版AJCC胃癌TNM分期标准。10例胃正常组织标本取自贲门癌手术标本距肿瘤边缘3 cm以上的胃切缘。

1.2   主要试剂

鼠抗人单克隆抗体MIF购自英国Abcam公司（上海艾博抗公司代购），浓缩型DAB试剂盒、通用型二步法PV-9000免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3   免疫组织化学检测

采用免疫组织化学Elivison二步法。将术后常规石蜡包埋的组织制成4 μm切片，脱蜡至水。置于枸橼酸盐修复液中（10 mmol/L,pH6.0），微波炉加热（100℃,10 min）行抗原修复，蒸馏水冲洗2次，磷酸盐缓冲液（PBS）洗3次，每次5 min；3%H2O2室温孵育10 min去除内源性过氧化物酶，PBS洗3次；按1:120稀释鼠抗人单克隆抗体MIF，加一抗后4℃过夜；PBS洗3次，加1滴聚合物增强剂（试剂A），室温孵育20 min后，PBS洗3次，滴加酶标抗鼠/兔聚合物（试剂B），室温孵育30 min，PBS洗3次；DAB显色，脱水透明，中性树胶封片。

1.4   结果判定

两位病理科医生应用双盲法观察确定。每例均随机观察5个高倍镜视野。用半定量积分法判断结果，（1）染色强度：0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。（2）阳性细胞所占百分比：0分为阴性，1分为阳性细胞≤10%，2分为阳性细胞10%~50%，3分为阳性细胞50%~75%，4分为阳性细胞>75%。两项记分相乘为最后结果，分为阴性（0~1分），弱阳性（2~4分），阳性（6~8分），强阳性（9~12分），其中阴性和弱阳性为低表达，阳性和强阳性为高表达。

1.5   随访

所有患者均获随访。随访时间从确定贲门癌手术之日起开始计算，即随访开始时间为2008年1月3日，随访时间截至2015年1月5日。随访方式为患者复诊、电话及其他方式。生存时间为自手术日至患者死亡时间或随访截止时间。

1.6   统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行数据处理，MIF表达与临床病理特征之间的关系采用Pearson χ²检验。Kaplan-Meier法绘制生存曲线，Log rank检验比较两组生存曲线有无差异。Cox回归模型行多因素分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2   结果

2.1   MIF在贲门癌中的表达

免疫组织化学结果显示，在73例贲门癌患者中，MIF高表达42例，高表达率为57.5%，低表达31例，低表达率为42.5%。MIF的阳性表达主要定位于肿瘤细胞的细胞质，癌旁正常胃组织不表达，见图 1~2。

图  1  贲门癌组织中MIF的表达 (IHC×400)

Figure  1  Expression of MIF in cardiac carcinoma tissues (IHC×400)

A: low MIF expression; B: high MIF expression

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图  2  胃正常组织中MIF的阴性表达 (IHC×400)

Figure  2  Negative MIF expression in gastric mucosae tissues (IHC×400)

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2.2   MIF表达与贲门癌患者临床病理特征的关系

MIF表达水平与患者的年龄、性别、肿瘤分化程度、有无淋巴结转移和TNM分期无关（P>0.05），与肿瘤的浸润深度有关（P=0.025），见表 1。

表  1  MIF表达与贲门癌患者临床病理特征的关系

Table  1  Relationship between MIF expression and clinicopathological features of cardiac carcinoma patients

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2.3   MIF表达与贲门癌患者预后的关系

73例贲门癌患者中，术后5年生存率为24.7%。MIF高表达患者与低表达患者术后5年生存率分别为14.3%、38.7%。MIF高表达组和低表达组的生存期用Kaplan-Meier方法评估，并用Log rank检验进行比较，两组之间生存率差异有统计学意义（P=0.001），见图 3。多因素Cox回归模型分析表明，淋巴结转移、MIF表达水平是影响贲门癌患者预后的独立危险因素（P<0.05），见表 2。

图  3  MIF高表达和低表达与贲门癌患者5年生存率的关系

Figure  3  Relationship between high and low expression of MIF and 5-year survival rates of cardiac carcinoma patients

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表  2  贲门癌患者多因素Cox模型分析结果

Table  2  Multivariate analysis of cardiac carcinoma patients by Cox regression

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3   讨论

MIF是一种多功能细胞因子，在炎性反应、免疫抑制及肿瘤的发展中发挥着重要的作用。它使巨噬细胞获得吞噬、黏附和迁移等功能，并通过多种信号转导通路，直接或间接影响着肿瘤的生长、增殖、浸润和转移^[4]。目前，越来越多的研究表明，MIF在肺癌^[5]、食管癌^[6]、胃癌^[7]、鼻咽癌^[8]、骨肉瘤^[9]等多种恶性肿瘤中均有表达，并与肿瘤预后有关。

在肿瘤形成过程中，炎性细胞产生有利于肿瘤生长的微环境，促进肿瘤细胞增殖^[10]。贲门所在部位特殊，黏膜受胃酸长期刺激，易引起慢性炎症，有研究表明胃食管返流是贲门癌发生的独立危险因素^[11]。本研究结果表明MIF在贲门癌组织中高表达与肿瘤浸润深度有关，说明MIF作为人体内重要的致炎因子参与了贲门癌的发生，提示MIF在贲门癌的生长、浸润过程中起着重要的作用。有研究表明^[12]，胃癌组织中幽门螺旋杆菌L型感染与MIF表现呈正相关，且MIF与肿瘤浸润深度有关，说明MIF既参与了炎性反应，又参与了肿瘤的生长。体外实验证实，C57BL6小鼠肺组织损伤修复过程中，MIF异常表达导致肿瘤生长，而MIF基因敲除后，未能促进肿瘤生长^[13]。另外，用靶向MIF的siRNA干扰MIF后，大肠癌CT-26细胞增殖受到抑制^[14]。均表明MIF通过某种途径参与肿瘤的发生、发展。

贲门癌的发病率呈上升趋势，因其有独特的解剖学部位和生物学特性，预后较差。本组贲门癌患者术后5年生存率为24.7%，与国内的研究报道相近^[15]。已有研究表明肿瘤浸润深度、淋巴结转移及病理分期等为影响贲门癌患者预后的因素^[16-17]。本研究也表明淋巴结转移为影响贲门癌预后的独立危险因素。为进一步探讨MIF表达与贲门癌患者生存的关系，MIF高表达组和低表达组的生存期用Kaplan-Meier方法评估，并用Log rank检验进行比较，两组之间生存率差异有统计学意义。MIF高表达组患者术后5年生存期明显低于MIF低表达组患者，提示MIF的表达水平可以影响贲门癌的生物学行为，是预后不良的指征，可以作为评估贲门癌患者生存期的生物学指标。同时经多因素分析，淋巴结转移和MIF表达水平是影响贲门癌患者预后的独立危险因素。提示贲门癌组织中MIF的表达水平对患者预后的判断有一定的指导意义。

综上所述，MIF高表达与贲门癌的浸润具有密切的关系，MIF表达增高提示贲门癌患者预后不良。MIF可作为一个影响贲门癌浸润和判断预后不良的指标，其参与肿瘤发展的途径应进一步研究。