0   引言

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率占全身各种恶性肿瘤的7%~10%，我国乳腺癌患者多为绝经前的女性，发病年龄相对早。三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer,TNBC）是指ER、PR、HER2均表达缺失的乳腺癌^[1]，约占15%~20%；与其他原发性乳腺癌亚型相比，缺乏治疗靶点（内分泌治疗及靶向治疗无效），预后最差；研究显示：TNBC患者5年生存率为86.2%，其预后与肿瘤直径、淋巴结转移、组织分级有关^[2]。Artemin蛋白基因位于染色体1p32~33区，编码雌激素（ER）调节生长因子；在乳腺癌组织中可促进对抗雌激素内分泌治疗的耐受，促进肿瘤细胞趋化、转移，增加侵袭能力^[3]。但是关于Artemin蛋白表达对三阴性及非三阴性乳腺癌生存率的影响，报道甚少。本研究针对河北医科大学附属沧州市中心医院2005年7月至2009年7月间收治的乳腺癌患者，随机抽取三阴性及非三阴性乳腺癌患者各120例作为研究对象。探讨蛋白Artemin对乳腺癌患者预后的影响。

1   资料与方法

1.1   临床资料

2005年7月至2009年7月河北医科大学附属沧州市中心医院收治符合入组标准的乳腺癌患者，采用随机数法随机抽取三阴性及非三阴性乳腺癌患者各120例进行统计学样本比较，患者知情同意并签署同意书，通过我院伦理委员会同意。入组标准：（1）术后病理证实为乳腺癌；（2）临床病理和统计资料完整，可进行TNM分期及免疫组织化学检查（雌激素受体ER，孕激素受体PR，表皮生长因子受体HER2表达水平）；（3）术前均无放化疗史，无内分泌治疗史。排除标准：（1）术后病理证实边缘肿瘤细胞残留阳性；（2）接受过肿瘤切除术的患者；（3）5年内有其他恶性肿瘤病史；（4）存在严重的共患疾病，导致干扰本研究的评估；（5）3月内参加过其他临床试验。

1.2   组织学评价

ER（SP1,1:200,Novocastra）及PR（16SAN27,1:200,Novocastra）阳性定义为≥1%肿瘤细胞核内表达激素受体标记阳性；HER2（4B5,Ventana） 呈（+++）时为阳性：>10%的肿瘤细胞呈现强的完整的细胞膜着色；（++）表示>10%时需行荧光原位杂交（FISH）确定。Artemin（EPR9763 1:200,Abcam）阳性定义为>50%肿瘤细胞膜或细胞质内表达激素受体标记阳性。所有试剂均按照说明书配比浓度进行稀释。染色步骤: 切片标本采用二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水。应用0.5%过氧化氢溶液对内源性过氧化物酶进行封闭（15 min），切片放入柠檬酸缓冲液（pH6.0）中，微波加热法进行抗原修复（150 s）。PBS溶液充分漂洗3次，每次3 min；再用3%普通马血清室温进行孵育20 min，以阻断非特性抗体。弃上清液，分别滴加一抗至于4℃冰箱中过夜12 h。取出标本室温复温5 min。弃上清液，滴加二抗（兔抗鼠IgG），37℃孵育30 min。PBS溶液充分漂洗3次，每次3 min，避光滴加DAB显色液（购自北京博奥森生物技术有限公司），复染、反蓝、封片。本结果判定由两名病理科医生分别进行评估。

三阴性乳腺癌TNBC定义为ER、PR、HER2均阴性^[4]；非三阴性乳腺癌non-TNBC定义为除TNBC外的乳腺癌。肿瘤TNM分期标准：参照第7版AJCCTNM分期进行^[5-6]。

1.3   观察指标

对本研究中所有病例进行回顾性分析。研究终点为：2014年7月。统计患者的总生存时间，1、3、5年生存率。

1.4   统计学方法

应用SPSS13.0软件进行统计分析，计量资料采用t检验，计数资料采用χ²检验，生存率统计采用寿命表法，生存曲线采用Kaplan-Meier曲线、组间比较采用Log rank检验，单因素比较乳腺癌患者的基本病理特征，多因素分析采用Cox比例风险模型分析预后相关性，取95%可信区间，P<0.05表示差异有统计学意义。

2   结果

本研究中2 4 0 乳腺癌患者病理资料分析：TNBC患者120例，non-TNBC患者120例，平均年龄分别为52和57.5岁，平均肿瘤直径2.0 cm（0.5~6.5cm）。蛋白Artemin阳性占61.7%、阴性占38.3%。TNM分期：Ⅰ期占12.1%，Ⅱ期占33.3%，Ⅲ期占54.6%。蛋白Artemin在TNBC中的阳性率为82.5%，non-TNBC中阳性率为41.0%；其分布差异具有统计学意义（P=0.01），见表 1。

表  1  乳腺癌患者临床病理资料

Table  1  Clinicopathological data of patients with breast cancer

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生存率分析显示：所有患者的总体1、3、5年生存率为96.0%、87.0%、74.0%。在TNBC组中蛋白Artemin阳性与阴性的患者1、3、5年生存率分别为93.0%、78.0%、50.0% vs. 100.0%、89.0%、79.0%；non-TNBC组中蛋白Artemin阳性与阴性的患者1、3、5年生存率分别为98.0%、89.0%、89.0% vs. 99.0%、97.0%、97.0%，四组比较差异具有统计学意义（P=0.0355），见图 1~2。

图  1  乳腺癌患者的生存曲线

Figure  1  Survival curve of patients with breast cancer

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图  2  蛋白Artemin阳性和阴性的TNBC和non-TNBC患者生存曲线

Figure  2  Survival curves of TNBC and non-TNBC patients with positive and negative Artemin expression

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多因素分析显示：绝经状态、肿瘤直径、淋巴结转移、肿瘤TNM分期、蛋白Artemin与乳腺癌患者生存率呈正相关，是影响预后的重要独立危险因素（P<0.05），见表 2。

表  2  影响TNBC和non-TNBC患者预后的多因素分析

Table  2  Multivariate analysis of prognosis factors for TNBC and non-TNBC patients

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3   讨论

乳腺癌是临床常见的恶性肿瘤,具有高度异质性的生物学特征，治疗方案需根据病理类型、分子生物学以及基因分型确定。国外St.Gallen指南^[4]指出Luminal A型对化疗不敏感、以内分泌治疗为主；Luminal B型主要为内分泌和（或）化疗或化疗+内分泌+抗HER2治疗为主；HER2过表达型以化疗+抗HER2治疗为主；但是TNBC无明显有效的治疗方案，预后极差。国内研究证明，TNBC占所有乳腺癌的15%~20%，3、5年生存率分别为85.5%和77.3%^[7]。TNBC是一个异质性群体，与基底细胞型腺癌很相似，能表达多种分子标志物如：p53、Ki67、CK5/6、Artemin等^[8]，容易出现早期复发和转移，并且临床侵袭性强。

Artemin蛋白基因位于染色体1p32~33区，编码113个氨基酸和7个保守的半胱氨酸残疾组成的Artemin蛋白，是GDNF家族四个成员中的一种，通过激活Ret信号途径发挥作用；在周围神经系统分布广泛，对多种神经元的生长、分化及迁移中均发挥明显的促进作用，这也是Artemin介导肿瘤细胞侵袭和转移的重要因素。研究显示Artemin和GFRɑ3通过增加MMP-2表达和下调E-cadherin表达而增强胰腺癌细胞沿神经运动和侵袭能力^[9]。此种Artemin的生物行为是否同样发生于乳腺癌组织中，进一步促进肿瘤细胞趋化、转移，增加侵袭能力。Banerjee等^[10]研究证明，在雌激素ER受体阴性的乳腺癌患者中Artemin调节血管内皮细胞行为，促进血管生成，其表达与VEGF-A呈正相关；激活下调Artemin蛋白的siRNA可抑制乳腺癌组织的血管生成，减少肿瘤复发/转移。可见Artemin蛋白是雌激素调节因素的一种。乳腺癌中Artemin的表达往往与化疗以后的复发率以及高死亡率相关。高表达的Artemin不仅能减低癌细胞对于常用化疗药物紫杉醇的敏感度，还降低了乳腺癌细胞对于电离辐射（放疗）的敏感度，其获得性耐受性是通过增加了肿瘤干细胞的群体比例来实现的。在乳腺癌发生发展的过程中，上调Artemin蛋白的表达，可使ER阴性的乳腺癌细胞对离子辐射和紫杉醇的获得性耐受；从而增加肿瘤细胞的侵袭能力。由此证明，增加Artemin蛋白的表达和功能，可能进一步促进肿瘤细胞的生存和更新，在肿瘤抗化疗/内分泌治疗中发挥重要作用[11]。

生存分析结果显示：乳腺癌中蛋白Artemin阳性148例（61.7%）、阴性232例（38.3%）；蛋白Artemin在TNBC中的阳性率为82.5%，non-TNBC中阳性率为41.0%；其分布差异具有统计学意义。TNBC组中蛋白Artemin阳性的患者1、3、5年生存率分别为93.0%、78.0%、50.0%，明显低于蛋白Artemin阴性的患者1、3、5年生存率100.0%、89.0%、79.0%；non-TNBC组中蛋白Artemin阳性的患者1、3、5年生存率分别为98.0%、89.0%、89.0%，明显低于蛋白Artemin阴性的患者1、3、5年生存率99.0%、97.0%、97.0%。提示蛋白Artemin是影响乳腺癌患者预后的重要指标。文献报道，TNBC患者中浸润性导管癌占84.1%，淋巴转移率36.3%，TNBC患者的5年总生存率分别为84.5%^[12]，与本研究略有差异。

三阴性乳腺癌患者发生局部复发和远处转移早于非三阴性乳腺癌，是辅助治疗失败及死亡的主要原因^[13]。国内研究^[14]显示影响乳腺癌患者预后的因素包括：直径、淋巴结转移、乳头浸润、病理分型、TNM分期、病理组织分级。Dent等^[15]研究报道三阴性乳腺癌的平均发病年龄为53岁，明显低于非三阴性的患者57.7岁，与本研究相似。多因素Cox模型分析显示：乳腺癌患者绝经状态、肿瘤直径、淋巴结转移、肿瘤TNM分期、蛋白Artemin与乳腺癌患者生存率呈正相关，生存率差异具有统计学意义（P<0.05）。提示肿瘤直径越大、淋巴结转移率越高、TNM分期越高、Artemin蛋白表达阳性率越高，患者预后越差、生存率越低，是影响患者预后的独立危险因素。说明Artemin蛋白在乳腺癌的进展中越发挥重要的作用，Artemin蛋白阳性表达率的高低也可作为判断临床分期及预后的一个分子指标。

总之，Artemin在乳腺癌中的表达及作用，有促进和诱导乳腺癌细胞浸润转移的作用。通过对Artemin的表达调控或基因转染方法，与其他化疗、放疗、等方法共同干预乳腺癌细胞微环境，达到抑制乳腺癌浸润转移、改善胰腺癌预后的目的，此方案值得进一步研究。